Alzheimers sykdom (AD) mangler proteinbiomarkører som reflekterer dens mange underliggende patofysiologi, og hindrer fremdriften av diagnose og behandling. Her bruker vi omfattende proteomikk for å identifisere cerebrospinalvæske (CSF) biomarkører som representerer et bredt spekter av AD patofysiologi. Multipleks massespektrometri identifiserte omtrent 3 500 og omtrent 12 000 proteiner i henholdsvis AD CSF og hjernen. Nettverksanalysen av hjerneproteomet løste 44 biodiversitetsmoduler, hvorav 15 overlappet med cerebrospinalvæskeproteomet. CSF AD-markørene i disse overlappende modulene er foldet inn i fem proteingrupper, som representerer forskjellige patofysiologiske prosesser. Synapsene og metabolittene i AD-hjernen reduseres, men CSF øker, mens de gliarike myelinerings- og immungruppene i hjernen og CSF øker. Konsistensen og sykdomsspesifisiteten til panelendringene ble bekreftet i mer enn 500 ytterligere CSF-prøver. Disse gruppene identifiserte også biologiske undergrupper i asymptomatisk AD. Samlet sett er disse resultatene et lovende skritt mot nettbaserte biomarkørverktøy for kliniske applikasjoner i AD.
Alzheimers sykdom (AD) er den vanligste årsaken til nevrodegenerativ demens over hele verden og er preget av et bredt spekter av biologiske systemdysfunksjoner, inkludert synaptisk overføring, glia-mediert immunitet og mitokondriell metabolisme (1-3). Imidlertid fokuserer dens etablerte proteinbiomarkører fortsatt på å oppdage amyloid- og tau-protein, og kan derfor ikke gjenspeile denne mangfoldige patofysiologien. Disse "kjerne" proteinbiomarkørene som er mest pålitelig målt i cerebrospinalvæske (CSF) inkluderer (i) amyloid beta peptid 1-42 (Aβ1-42), som reflekterer dannelsen av kortikale amyloidplakk; (ii) total tau, et tegn på aksondegenerasjon; (iii) fosfo-tau (p-tau), en representant for patologisk tau-hyperfosforylering (4-7). Selv om disse cerebrospinalvæskebiomarkørene i stor grad har forenklet vår påvisning av "merkede" AD-proteinsykdommer (4-7), representerer de bare en liten del av den komplekse biologien bak sykdommen.
Mangelen på patofysiologisk mangfold av AD-biomarkører har ført til mange utfordringer, inkludert (i) manglende evne til å identifisere og kvantifisere den biologiske heterogeniteten til AD-pasienter, (ii) utilstrekkelig måling av sykdommens alvorlighetsgrad og progresjon, spesielt i det prekliniske stadiet, og ( iii) utvikling av terapeutiske legemidler som ikke klarte å fullstendig løse alle aspekter av nevrologisk forverring. Vår avhengighet av landemerkepatologi for å beskrive AD fra relaterte sykdommer forverrer bare disse problemene. Flere og flere bevis viser at de fleste eldre med demens har mer enn én patologisk egenskap ved kognitiv svikt (8). Så mange som 90 % eller flere av individer med AD-patologi har også vaskulær sykdom, TDP-43-inneslutninger eller andre degenerative sykdommer (9). Disse høye andelene av patologisk overlapping har forstyrret vårt nåværende diagnostiske rammeverk for demens, og en mer omfattende patofysiologisk definisjon av sykdommen er nødvendig.
I lys av det presserende behovet for en rekke AD-biomarkører, tar feltet i økende grad i bruk "omics"-metoden basert på det overordnede systemet for å oppdage biomarkører. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance ble lansert i 2014 og er i forkant av programmet. Denne tverrfaglige innsatsen fra National Institutes of Health, akademia og industri tar sikte på å bruke systembaserte strategier for å bedre definere patofysiologien til AD og utvikle diagnostiske analyser og behandlingsstrategier for biologisk mangfold (10). Som en del av dette prosjektet har nettverksproteomikk blitt et lovende verktøy for å fremme systembaserte biomarkører i AD. Denne objektive datadrevne tilnærmingen organiserer komplekse proteomikkdatasett i grupper eller "moduler" av co-uttrykte proteiner som er assosiert med spesifikke celletyper, organeller og biologiske funksjoner (11-13). Nesten 12 informasjonsrike nettverksproteomikkstudier er utført på AD-hjernen (13-23). Samlet sett indikerer disse analysene at AD-hjernenettverksproteomet opprettholder en svært bevart modulær organisasjon i uavhengige kohorter og flere kortikale regioner. I tillegg viser noen av disse modulene reproduserbare endringer i AD-relatert overflod på tvers av datasett, noe som gjenspeiler patofysiologien til flere sykdommer. Samlet viser disse funnene et lovende ankerpunkt for oppdagelsen av hjernenettverksproteomet som en systembasert biomarkør i AD.
For å transformere AD-hjernenettverksproteomet til klinisk nyttige systembaserte biomarkører, kombinerte vi det hjerneavledede nettverket med den proteomiske analysen av AD CSF. Denne integrerte tilnærmingen førte til identifisering av fem lovende sett med CSF-biomarkører som er assosiert med et bredt spekter av hjernebasert patofysiologi, inkludert synapser, blodkar, myelinisering, betennelse og dysfunksjon av metabolske veier. Vi validerte disse biomarkørpanelene med hell gjennom flere replikasjonsanalyser, inkludert mer enn 500 CSF-prøver fra forskjellige nevrodegenerative sykdommer. Disse valideringsanalysene inkluderer å undersøke gruppemål i CSF hos pasienter med asymptomatisk AD (AsymAD) eller vise bevis på unormal amyloidakkumulering i et normalt kognitivt miljø. Disse analysene fremhever den betydelige biologiske heterogeniteten i AsymAD-populasjonen og identifiserer panelmarkører som kan være i stand til å subtype individer i de tidligste stadiene av sykdommen. Samlet sett representerer disse resultatene et nøkkeltrinn i utviklingen av proteinbiomarkørverktøy basert på flere systemer som med hell kan løse mange av de kliniske utfordringene AD står overfor.
Hovedformålet med denne studien er å identifisere nye cerebrospinalvæskebiomarkører som reflekterer ulike hjernebaserte patofysiologi som fører til AD. Figur S1 skisserer vår forskningsmetodikk, som inkluderer (i) en omfattende analyse drevet av foreløpige funn av AD CSF og nettverkshjerneproteomet for å identifisere flere hjernerelaterte CSF-sykdomsbiomarkører, og (ii) påfølgende replikering Disse biomarkørene er i flere uavhengige cerebrospinale flytende kohorter. Den oppdagelsesorienterte forskningen startet med analysen av det differensielle uttrykket av CSF hos 20 kognitivt normale individer og 20 AD-pasienter ved Emory Goizueta Alzheimers sykdomsforskningssenter (ADRC). Diagnosen AD er definert som en signifikant kognitiv svikt i nærvær av lav Aβ1-42 og forhøyede nivåer av total tau og p-tau i cerebrospinalvæsken [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabell S1A). Kontrollen (gjennomsnittlig MoCA, 26,7 ± 2,2) hadde normale nivåer av CSF-biomarkører.
Human CSF er preget av et dynamisk utvalg av proteinoverflod, der albumin og andre ekstremt rikelige proteiner kan forhindre påvisning av proteiner av interesse (24). For å øke dybden av proteinoppdagelsen fjernet vi de første 14 svært rikelig proteinene fra hver CSF-prøve før massespektrometri (MS) analyse (24). Totalt 39 805 peptider ble identifisert av MS, som ble kartlagt til 3691 proteomer i 40 prøver. Proteinkvantifisering utføres ved multippel tandem massetag (TMT) merking (18, 25). For å løse de manglende dataene inkluderte vi bare de proteinene som ble kvantifisert i minst 50% av prøvene i den påfølgende analysen, og kvantifiserte dermed til slutt 2875 proteomer. På grunn av den signifikante forskjellen i total proteinmengde, ble en kontrollprøve statistisk sett ansett som en uteligger (13) og ble ikke inkludert i den påfølgende analysen. Overflodsverdiene til de resterende 39 prøvene ble justert i henhold til alder, kjønn og batch-kovarians (13-15, 17, 18, 20, 26).
Ved å bruke statistisk t-testanalyse for å evaluere differensielt uttrykk på regresjonsdatasettet, identifiserte denne analysen proteiner hvis overflodsnivåer ble betydelig endret (P <0,05) mellom kontroll- og AD-tilfellene (tabell S2A). Som vist i figur 1A ble overfloden av totalt 225 proteiner i AD betydelig redusert, og forekomsten av 303 proteiner ble betydelig økt. Disse differensielt uttrykte proteinene inkluderer flere tidligere identifiserte cerebrospinalvæske AD-markører, for eksempel mikrotubule-assosiert protein tau (MAPT; P = 3,52 × 10−8), nevrofilament (NEFL; P = 6,56 × 10−3), vekstrelatert protein 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Fettsyrebindende Protein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Kitinase 3 som 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) og VGF nervevekstfaktor (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Imidlertid identifiserte vi også andre svært viktige mål, som GDP-dissosiasjonshemmer 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) og SPARC-relatert modulær kalsiumbinding 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Gene Ontology (GO) analyse av 225 signifikant reduserte proteiner avslørte nære forbindelser med kroppsvæskeprosesser som steroidmetabolisme, blodkoagulasjon og hormonaktivitet (Figur 1B og Tabell S2B). Derimot er det betydelig økte proteinet til 303 nært knyttet til cellestruktur og energimetabolisme.
(A) Vulkanplottet viser log2-foldsendringen (x-aksen) i forhold til -log10 statistiske P-verdi (y-aksen) oppnådd ved t-testen, som brukes til å oppdage differensialuttrykk mellom kontrollen (CT) og AD-tilfeller av CSF-proteomet av alle proteiner. Proteiner med signifikant reduserte nivåer (P <0,05) i AD er vist i blått, mens proteiner med signifikant økte nivåer av sykdom er vist i rødt. Det valgte proteinet er merket. (B) De øverste GO-begrepene relatert til protein er betydelig redusert (blå) og økt (rød) i AD. Viser de tre GO-begrepene med de høyeste z-skårene innen biologiske prosesser, molekylære funksjoner og cellulære komponenter. (C) MS målte MAPT-nivå i CSF-prøve (venstre) og dens korrelasjon med prøve-ELISA tau-nivå (høyre). Pearson-korrelasjonskoeffisienten med den relevante P-verdien vises. På grunn av mangelen på ELISA-data for ett AD-tilfelle, inkluderer disse tallene verdier for 38 av de 39 analyserte tilfellene. (D) Overvåket klyngeanalyse (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) justert P <0,01) på kontrollen og AD CSF fant prøver ved bruk av de 65 mest signifikant endrede proteinene i datasettet. Standardisere, normalisere.
Det proteomiske nivået til MAPT er nært knyttet til det uavhengig målte ELISA tau-nivået (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; figur 1C), noe som støtter gyldigheten av MS-målingen vår. Etter trypsinfordøyelse på nivået av amyloid forløperprotein (APP), kan ikke de isoformspesifikke peptidene kartlagt til C-terminalen av Aβ1-40 og Aβ1-42 ioniseres effektivt (27, 28). Derfor har APP-peptidene vi identifiserte ingenting å gjøre med ELISA Aβ1-42-nivåer. For å evaluere det differensielle uttrykket i hvert tilfelle brukte vi differensielt uttrykte proteiner med P <0,0001 [falsk oppdagelsesrate (FDR) korrigert P <0,01] for å utføre en overvåket klyngeanalyse av prøvene (tabell S2A). Som vist i figur 1D, kan disse 65 svært signifikante proteinene korrekt gruppere prøver i henhold til sykdomstilstand, bortsett fra ett AD-tilfelle med kontrolllignende egenskaper. Av disse 65 proteinene økte 63 i AD, mens bare to (CD74 og ISLR) gikk ned. Totalt har disse cerebrospinalvæskeanalysene identifisert hundrevis av proteiner i AD som kan tjene som sykdomsbiomarkører.
Deretter utførte vi en uavhengig nettverksanalyse av AD-hjerneproteomet. Hjernekohorten til denne oppdagelsen inkluderte dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) fra kontroll (n = 10), Parkinsons sykdom (PD; n = 10), blandet AD/PD (n = 10) og AD (n = 10) tilfeller. ) Prøve. Emery Goizueta ADRC. Demografien til disse 40 tilfellene er tidligere beskrevet (25) og er oppsummert i tabell S1B. Vi brukte TMT-MS for å analysere disse 40 hjernevevene og replikasjonskohorten på 27 tilfeller. Totalt produserte disse to hjernedatasettene 227 121 unike peptider, som ble kartlagt til 12 943 proteomer (25). Bare de proteinene som ble kvantifisert i minst 50 % av tilfellene ble inkludert i påfølgende undersøkelser. Det endelige funndatasettet inneholder 8817 kvantifiserte proteiner. Juster proteinoverflodsnivåer basert på alder, kjønn og post-mortem-intervall (PMI). Den differensielle ekspresjonsanalysen av datasettet etter regresjon viste at >2000 proteinnivåer ble signifikant endret [P <0,05, variansanalyse (ANOVA)] i to eller flere sykdomskohorter. Deretter utførte vi en overvåket klyngeanalyse basert på de differensielt uttrykte proteinene, og P <0,0001 i AD/kontroll og/eller AD/PD-sammenligninger (Figur S2, A og B, Tabell S2C). Disse 165 sterkt endrede proteinene viser tydelig tilfeller med AD-patologi fra kontroll- og PD-prøvene, og bekrefter de sterke AD-spesifikke endringene i hele proteomet.
Vi brukte deretter en algoritme kalt Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) for å utføre nettverksanalyse på det oppdagede hjerneproteomet, som organiserer datasettet i proteinmoduler med lignende uttrykksmønstre (11-13). Analysen identifiserte 44 moduler (M) co-uttrykte proteiner, sortert og nummerert fra de største (M1, n = 1821 proteiner) til de minste (M44, n = 34 proteiner) (Figur 2A og Tabell S2D) ). Som nevnt ovenfor (13) Beregn den representative ekspresjonsprofilen eller det karakteristiske proteinet til hver modul, og korreler det med sykdomstilstanden og AD-patologien, det vil si etablere alliansen mellom Alzheimers sykdomsregister (CERAD) og Braak Score (Figur 2B). Totalt sett var 17 moduler signifikant relatert til AD-nevropatologi (P <0,05). Mange av disse sykdomsrelaterte modulene er også rike på celletypespesifikke markører (figur 2B). Som nevnt ovenfor (13), bestemmes celletypeanrikning ved å analysere moduloverlappingen og referanselisten over celletypespesifikke gener. Disse genene er avledet fra publiserte data i isolerte museneuroner, endotelceller og gliaceller. RNA-sekvenseringseksperiment (RNA-seq) (29).
(A) Oppdag WGCNA til hjerneproteomet. (B) Tovekts midtkorrelasjonsanalyse (BiCor) av det modulære signaturproteinet (den første hovedkomponenten i modulært proteinuttrykk) med AD nevropatologiske egenskaper (øverst), inkludert CERAD (Aβ plakk) og Braak (tau floker)-score. Intensiteten til positive (røde) og negative (blå) korrelasjoner vises av et tofarget varmekart, og stjerner indikerer statistisk signifikans (P <0,05). Bruk Hypergeometric Fishers eksakte test (FET) (nederst) for å vurdere celletypetilknytningen til hver proteinmodul. Intensiteten til den røde skyggen indikerer graden av celletypeberikelse, og stjernen indikerer statistisk signifikans (P <0,05). Bruk BH-metoden for å korrigere P-verdien utledet fra FET. (C) GO-analyse av modulære proteiner. De mest beslektede biologiske prosessene er vist for hver modul eller relatert modulgruppe. oligo, oligodendrocytt.
Et sett med fem nært beslektede astrocytt- og mikroglia-rike moduler (M30, M29, M18, M24 og M5) viste en sterk positiv korrelasjon med AD-nevropatologi (Figur 2B). Ontologianalyse kobler disse gliamodulene med cellevekst, spredning og immunitet (figur 2C og tabell S2E). To ekstra gliamoduler, M8 og M22, er også sterkt oppregulert ved sykdom. M8 er sterkt relatert til Toll-like reseptorveien, en signalkaskade som spiller en nøkkelrolle i den medfødte immunresponsen (30). Samtidig er M22 nært knyttet til post-translasjonell modifikasjon. M2, som er rik på oligodendrocytter, viser en sterk positiv korrelasjon med AD-patologi og en ontologisk forbindelse med nukleosidsyntese og DNA-replikasjon, noe som indikerer forbedret celleproliferasjon ved sykdommer. Samlet sett støtter disse funnene høyden av glialmoduler som vi tidligere har observert i AD-nettverksproteomet (13, 17). Det er for tiden funnet at mange AD-relaterte gliamoduler i nettverket viser lavere ekspresjonsnivåer i kontroll- og PD-tilfeller, og fremhever deres sykdomsspesifisitet som er forhøyet i AD (Figur S2C).
Bare fire moduler i nettverksproteomet vårt (M1, M3, M10 og M32) er sterkt negativt korrelert med AD-patologi (P <0,05) (Figur 2, B og C). Både M1 og M3 er rike på nevronale markører. M1 er sterkt relatert til synaptiske signaler, mens M3 er nært knyttet til mitokondriell funksjon. Det er ingen bevis for celletypeanrikning for M10 og M32. M32 reflekterer sammenhengen mellom M3 og cellemetabolisme, mens M10 er sterkt relatert til cellevekst og mikrotubulus funksjon. Sammenlignet med AD, er alle fire moduler økt i kontroll og PD, noe som gir dem sykdomsspesifikke AD-endringer (Figur S2C). Samlet sett støtter disse resultatene den reduserte mengden av nevronrike moduler som vi tidligere har observert i AD (13, 17). Oppsummert produserte nettverksanalysen av hjerneproteomet som vi oppdaget AD-spesifikt endrede moduler i samsvar med våre tidligere funn.
AD karakteriseres av et tidlig asymptomatisk stadium (AsymAD), der individer viser amyloidakkumulering uten klinisk kognitiv nedgang (5, 31). Dette asymptomatiske stadiet representerer et kritisk vindu for tidlig oppdagelse og intervensjon. Vi har tidligere demonstrert sterk modulær bevaring av AsymAD og AD hjernenettverksproteom på tvers av uavhengige datasett (13, 17). For å sikre at hjernenettverket vi for øyeblikket oppdaget stemmer overens med disse tidligere funnene, analyserte vi bevaringen av 44 moduler i det replikerte datasettet fra 27 DLPFC-organisasjoner. Disse organisasjonene inkluderer kontroll (n = 10), AsymAD (n = 8 ) og AD (n = 9) tilfeller. Kontroll- og AD-prøver ble inkludert i analysen av vår oppdagelseshjernekohort (tabell S1B), mens AsymAD-tilfeller bare var unike i replikasjonskohorten. Disse AsymAD-tilfellene kom også fra Emory Goizueta ADRC-hjernebanken. Selv om kognisjon var normal på dødstidspunktet, var amyloidnivåene unormalt høye (gjennomsnittlig CERAD, 2,8 ± 0,5) (tabell S1B).
TMT-MS-analyse av disse 27 hjernevevet resulterte i kvantifisering av 11 244 proteomer. Denne endelige tellingen inkluderer bare de proteinene som er kvantifisert i minst 50 % av prøvene. Dette replikerte datasettet inneholder 8638 (98,0%) av de 8817 proteinene som ble oppdaget i hjerneanalysen vår, og har nesten 3000 signifikant endrede proteiner mellom kontroll- og AD-kohortene (P <0,05, etter Tukeys parede t-test for variansanalyse) ( Tabell S2F). Blant disse differensielt uttrykte proteinene, viste 910 også signifikante nivåendringer mellom AD og hjerneproteomkontrolltilfeller (P <0,05, etter ANOVA Tukey paret t-test). Det er verdt å merke seg at disse 910 markørene er svært konsistente i retning av endring mellom proteomer (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Figur S3A). Blant de økte proteinene er proteinene med de mest konsistente endringene mellom datasett hovedsakelig medlemmer av de glialrike M5- og M18-modulene (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 og GFAP). Blant de reduserte proteinene var de med de mest konsistente endringene nesten utelukkende medlemmer av M1-modulen (NPTX2, VGF og RPH3A) assosiert med synapsen. Vi bekreftet videre de AD-relaterte endringene av midkine (MDK), CD44, utskilt frizzled-relatert protein 1 (SFRP1) og VGF ved western blotting (figur S3B). Modulkonserveringsanalyse viste at omtrent 80 % av proteinmodulene (34/44) i hjerneproteomet var betydelig bevart i replikasjonsdatasettet (z-score> 1,96, FDR-korrigert P <0,05) (Figur S3C). Fjorten av disse modulene var spesielt reservert mellom de to proteomene (z-score> 10, FDR-korrigert P <1,0 × 10−23). Samlet sett fremhever oppdagelsen og replikasjonen av den høye graden av konsistens i differensielt uttrykk og modulær sammensetning mellom hjerneproteomet reproduserbarheten av endringene i AD frontale cortex-proteiner. I tillegg bekreftet den også at AsymAD og mer avanserte sykdommer har en veldig lik hjernenettverksstruktur.
En mer detaljert analyse av det differensielle uttrykket i hjernereplikasjonsdatasettet fremhever den betydelige graden av AsymAD-proteinendringer, inkludert totalt 151 signifikant endrede proteiner mellom AsymAD og kontrollen (P <0,05) (Figur S3D). I samsvar med amyloidbelastningen økte APP i hjernen til AsymAD og AD betydelig. MAPT endrer seg bare signifikant i AD, noe som stemmer overens med økte nivåer av floker og dets kjente korrelasjon med kognitiv nedgang (5, 7). De glialrike modulene (M5 og M18) gjenspeiles sterkt i de økte proteinene i AsymAD, mens den nevronrelaterte M1-modulen er den mest representative for de reduserte proteinene i AsymAD. Mange av disse AsymAD-markørene viser større endringer i symptomatiske sykdommer. Blant disse markørene er SMOC1, et gliaprotein tilhørende M18, som er assosiert med hjernesvulster og utvikling av øyne og lemmer (32). MDK er en heparinbindende vekstfaktor relatert til cellevekst og angiogenese (33), et annet medlem av M18. Sammenlignet med kontrollgruppen økte AsymAD betydelig, etterfulgt av en større økning i AD. Derimot ble det synaptiske proteinet neuropentraxin 2 (NPTX2) betydelig redusert i AsymAD-hjernen. NPTX2 var tidligere assosiert med nevrodegenerasjon og har en anerkjent rolle i å formidle eksitatoriske synapser (34). Totalt sett avslører disse resultatene en rekke forskjellige prekliniske proteinendringer i AD som ser ut til å utvikle seg med alvorlighetsgraden av sykdommen.
Gitt at vi har oppnådd en betydelig dybde av proteindekning i oppdagelsen av hjerneproteomet, prøver vi å forstå mer fullstendig dets overlapping med AD-transkriptomet på nettverksnivå. Derfor sammenlignet vi hjerneproteomet vi oppdaget med modulen vi tidligere genererte fra mikroarray-målingen av 18 204 gener i AD (n = 308) og kontroll (n = 157) DLPFC-vev (13). overlappende. Totalt identifiserte vi 20 forskjellige RNA-moduler, hvorav mange demonstrerte berikelsen av spesifikke celletyper, inkludert nevroner, oligodendrocytter, astrocytter og mikroglia (Figur 3A). De mange endringene av disse modulene i AD er vist i figur 3B. I samsvar med vår tidligere protein-RNA-overlappingsanalyse ved bruk av det dypere umerkede MS-proteomet (ca. 3000 proteiner) (13), er de fleste av de 44 modulene i hjerneproteomnettverket vi fant i transkriptomnettverket. Det er ingen signifikant overlapping i. Selv i vår oppdagelse og replikering av de 34 proteinmodulene som er sterkt beholdt i hjerneproteomet, bare 14 (~40%) besto Fishers eksakte test (FET) viste seg å ha en statistisk signifikant overlapping med transkriptomet (Figur 3A). Kompatibel med reparasjon av DNA-skader (P-M25 og P-M19), proteintranslasjon (P-M7 og P-M20), RNA-binding/spleising (P-M16 og P-M21) og proteinmålretting (P-M13 og P- M23) overlapper ikke med moduler i transkriptomet. Derfor, selv om et dypere proteomdatasett brukes i den nåværende overlappingsanalysen (13), er det meste av AD-nettverksproteomet ikke kartlagt til transkriptomnettverket.
(A) Hypergeometrisk FET demonstrerer berikelsen av celletypespesifikke markører i RNA-modulen til AD-transkriptomet (øverst) og graden av overlapping mellom RNA- (x-aksen) og protein- (y-aksen) modulene i AD-hjernen (nederst). Intensiteten til den røde skyggen indikerer graden av berikelse av celletyper i topppanelet og intensiteten av overlappingen av modulene i bunnpanelet. Stjerner indikerer statistisk signifikans (P <0,05). (B) Graden av korrelasjon mellom de karakteristiske genene til hver transkriptommodul og AD-status. Modulene til venstre er de mest negativt korrelerte med AD (blå), og de til høyre er de mest positivt korrelerte med AD (rød). Den log-transformerte BH-korrigerte P-verdien indikerer graden av statistisk signifikans for hver korrelasjon. (C) Betydelige overlappende moduler med delt celletypeberikelse. (D) Korrelasjonsanalyse av log2-fold endringen av det merkede proteinet (x-aksen) og RNA (y-aksen) i den overlappende modulen. Pearson-korrelasjonskoeffisienten med den relevante P-verdien vises. Mikro, mikroglia; himmellegemer, astrocytter. CT, kontroll.
De fleste overlappende protein- og RNA-moduler deler lignende celletypeanrikningsprofiler og konsekvente AD-endringsretninger (figur 3, B og C). Med andre ord, den synapserelaterte M1-modulen til hjerneproteomet (PM1) er kartlagt til tre nevronrike homologe RNA-moduler (R-M1, R-M9 og R-M16), som er i AD. Begge viste et redusert nivå. Tilsvarende overlapper de glialrike M5- og M18-proteinmodulene med RNA-moduler rike på astrocytter og mikrogliale markører (R-M3, R-M7 og R-M10) og er sterkt involvert i sykdommer Økning. Disse delte modulære funksjonene mellom de to datasettene støtter videre celletypeberikelsen og sykdomsrelaterte endringer vi har observert i hjerneproteomet. Imidlertid observerte vi mange signifikante forskjeller mellom RNA- og proteinnivåene til individuelle markører i disse delte modulene. Korrelasjonsanalyse av det differensielle uttrykket av proteomikken og transkriptomikken til molekylene i disse overlappende modulene (figur 3D) fremhever denne inkonsekvensen. For eksempel viste APP og flere andre gliamodulproteiner (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 og SFRP1) en signifikant økning i AD-proteomet, men det var nesten ingen endring i AD-transkriptomet. Disse proteinspesifikke endringene kan være nært knyttet til amyloidplakk (23, 35), noe som fremhever proteomet som kilden til patologiske endringer, og disse endringene kan ikke reflekteres i transkriptomet.
Etter uavhengig analyse av hjernen og CSF-proteomene vi oppdaget, utførte vi en omfattende analyse av de to datasettene for å identifisere AD CSF-biomarkører relatert til patofysiologien til hjernenettverket. Vi må først definere overlappingen av de to proteomene. Selv om det er allment akseptert at CSF reflekterer nevrokjemiske endringer i AD-hjernen (4), er den nøyaktige graden av overlapping mellom AD-hjernen og CSF-proteomet uklar. Ved å sammenligne antall delte genprodukter som ble oppdaget i våre to proteomer, fant vi at nesten 70 % (n = 1936) av proteinene identifisert i cerebrospinalvæsken også ble kvantifisert i hjernen (Figur 4A). De fleste av disse overlappende proteinene (n = 1721) er kartlagt til en av 44 co-ekspresjonsmoduler fra oppdagelseshjernedatasettet (Figur 4B). Som forventet viste de seks største hjernemodulene (M1 til M6) den største mengden CSF-overlapping. Det finnes imidlertid mindre hjernemoduler (for eksempel M15 og M29) som oppnår en uventet høy grad av overlapping, større enn en hjernemodul som er dobbelt så stor. Dette motiverer oss til å ta i bruk en mer detaljert, statistisk drevet metode for å beregne overlappingen mellom hjernen og cerebrospinalvæsken.
(A og B) Proteinene oppdaget i oppdagelseshjernen og CSF-datasettene overlapper hverandre. De fleste av disse overlappende proteinene er assosiert med en av de 44 co-ekspresjonsmodulene i hjernens co-ekspresjonsnettverk. (C) Oppdag overlappingen mellom cerebrospinalvæskeproteomet og hjernenettverkets proteom. Hver rad på varmekartet representerer en separat overlappingsanalyse av den hypergeometriske FET. Den øverste raden viser overlappingen (grå/svart skyggelegging) mellom hjernemodulen og hele CSF-proteomet. Den andre linjen viser at overlappingen mellom hjernemoduler og CSF-protein (farget i rødt) er betydelig oppregulert i AD (P <0,05). Den tredje raden viser at overlappingen mellom hjernemoduler og CSF-protein (blå skyggelegging) er betydelig nedregulert i AD (P <0,05). Bruk BH-metoden for å korrigere P-verdien utledet fra FET. (D) Foldemodulpanel basert på celletypetilknytning og relaterte GO-termer. Disse panelene inneholder totalt 271 hjernerelaterte proteiner, som har meningsfullt differensielt uttrykk i CSF-proteomet.
Ved å bruke enkelthalede FET-er vurderte vi viktigheten av proteinoverlapping mellom CSF-proteomet og individuelle hjernemoduler. Analysen viste at totalt 14 hjernemoduler i CSF-datasettet har statistisk signifikante overlappinger (FDR justert P <0,05), og en tilleggsmodul (M18) hvis overlapping er nær signifikans (FDR justert P = 0,06) (Figur 4C) , øverste rad). Vi er også interessert i moduler som sterkt overlapper med differensielt uttrykte CSF-proteiner. Derfor brukte vi ytterligere to FET-analyser for å bestemme hvilket av (i) CSF-protein som var signifikant økt i AD og (ii) CSF-protein ble signifikant redusert i AD (P <0,05, paret t-test AD/kontroll) Hjernemoduler med meningsfull overlapping mellom dem. Som vist i de midterste og nederste radene i figur 4C, viser disse tilleggsanalysene at 8 av de 44 hjernemodulene overlapper betydelig med proteinet tilsatt i AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 og M38) . ), mens bare to moduler (M6 og M15) viste en meningsfull overlapping med det reduserte proteinet i AD CSF. Som forventet er alle 10 moduler i de 15 modulene med høyest overlapping med CSF-proteomet. Derfor antar vi at disse 15 modulene er høyytelseskilder for AD-hjerneavledede CSF-biomarkører.
Vi brettet disse 15 overlappende modulene til fem store proteinpaneler basert på deres nærhet i WGCNA-trediagrammet og deres assosiasjon med celletyper og genontologi (Figur 4D). Det første panelet inneholder moduler rike på nevronmarkører og synapserelaterte proteiner (M1 og M12). Det synaptiske panelet inneholder totalt 94 proteiner, og nivåene i CSF-proteomet har endret seg betydelig, noe som gjør det til den største kilden til hjernerelaterte CSF-markører blant de fem panelene. Den andre gruppen (M6 og M15) demonstrerte den nære forbindelsen med endotelcellemarkører og vaskulær kropp, slik som "sårheling" (M6) og "regulering av humoral immunrespons" (M15). M15 er også sterkt relatert til lipoproteinmetabolisme, som er nært beslektet med endotel (36). Det vaskulære panelet inneholder 34 CSF-markører relatert til hjernen. Den tredje gruppen inkluderer moduler (M2 og M4) som er signifikant relatert til oligodendrocyttmarkører og celleproliferasjon. For eksempel inkluderer toppnivå-ontologibetingelsene til M2 "positiv regulering av DNA-replikasjon" og "purinbiosynteseprosess". I mellomtiden inkluderer de av M4 "glialcelledifferensiering" og "kromosomsegregering". Myeliniseringspanelet inneholder 49 CSF-markører relatert til hjernen.
Den fjerde gruppen inneholder flest moduler (M30, M29, M18, M24 og M5), og nesten alle moduler er betydelig rike på mikroglia og astrocyttmarkører. I likhet med myeliniseringspanelet inneholder det fjerde panelet også moduler (M30, M29 og M18) som er nært knyttet til celleproliferasjon. De andre modulene i denne gruppen er sterkt relatert til immunologiske termer, som «immun effektprosess» (M5) og «immunresponsregulering» (M24). Glialimmungruppen inneholder 42 CSF-markører relatert til hjernen. Til slutt inneholder det siste panelet 52 hjernerelaterte markører på de fire modulene (M44, M3, M33 og M38), som alle er på kroppen relatert til energilagring og metabolisme. Den største av disse modulene (M3) er nært beslektet med mitokondrier og er rik på nevronspesifikke markører. M38 er et av de mindre modulmedlemmene i dette metabolomet og viser også moderat nevronspesifisitet.
Totalt sett reflekterer disse fem panelene et bredt spekter av celletyper og funksjoner i AD cortex, og inneholder til sammen 271 hjernerelaterte CSF-markører (tabell S2G). For å evaluere gyldigheten av disse MS-resultatene, brukte vi proximity extension assay (PEA), en ortogonal antistoff-basert teknologi med multiplekseringsevne, høy sensitivitet og spesifisitet, og reanalyserte cerebrospinalvæskeprøvene vi fant En undergruppe av disse 271 biomarkørene (n = 36). Disse 36 målene viser endringen i AD-multippelet til PEA, som er nært knyttet til våre MS-baserte funn (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), som sterkt bekreftet resultatene av vår omfattende MS-analyse (Figur S4) ).
De biologiske temaene som vektlegges av våre fem grupper, fra synaptisk signalering til energimetabolisme, er alle relatert til patogenesen av AD (1-3). Derfor er alle 15 moduler som inneholder disse panelene relatert til AD-patologien i hjerneproteomet som vi oppdaget (Figur 2B). Den mest bemerkelsesverdige er den høye positive patologiske korrelasjonen mellom gliamodulene våre og den sterke negative patologiske korrelasjonen mellom våre største nevronmoduler (M1 og M3). Den differensielle ekspresjonsanalysen av vårt replikerte hjerneproteom (figur S3D) fremhever også M5- og M18-avledede gliaproteiner. Ved AsymAD og symptomatisk AD er de mest økte gliaproteinene og M1-relaterte synapser. Proteinet reduseres mest. Disse observasjonene indikerer at de 271 cerebrospinalvæskemarkørene vi identifiserte i de fem gruppene er relatert til sykdomsprosesser i AD cortex, inkludert de som oppstår i de tidlige asymptomatiske stadiene.
For å bedre analysere endringsretningen til panelproteinene i hjernen og spinalvæsken, tegnet vi følgende for hver av de 15 overlappende modulene: (i) fant moduloverflodsnivået i hjernedatasettet og (ii) modulen protein Forskjellen kommer til uttrykk i cerebrospinalvæsken (Figur S5). Som nevnt tidligere, brukes WGCNA for å bestemme moduloverfloden eller karakteristisk proteinverdi i hjernen (13). Vulkankartet brukes til å beskrive det differensielle uttrykket av modulære proteiner i cerebrospinalvæsken (AD/kontroll). Disse figurene viser at tre av de fem panelene viser ulike uttrykkstrender i hjernen og spinalvæsken. De to modulene til synapsepanelet (M1 og M12) viser en reduksjon i overflodsnivået i AD-hjernen, men overlapper betydelig med det økte proteinet i AD CSF (Figur S5A). De nevronrelaterte modulene som inneholder metabolomet (M3 og M38) viste lignende uttrykksmønstre for hjerne og cerebrospinalvæske inkonsekvente (figur S5E). Det vaskulære panelet viste også forskjellige uttrykkstrender, selv om modulene (M6 og M15) ble moderat økt i AD-hjernen og redusert i den syke CSF (Figur S5B). De resterende to panelene inneholder store glialnettverk hvis proteiner er konsekvent oppregulert i begge rom (figur S5, C og D).
Vær oppmerksom på at disse trendene ikke er felles for alle markører i disse panelene. For eksempel inkluderer det synaptiske panelet flere proteiner som er betydelig redusert i AD-hjernen og CSF (Figur S5A). Blant disse nedregulerte cerebrospinalvæskemarkørene er NPTX2 og VGF av M1, og kromogranin B av M12. Til tross for disse unntakene er imidlertid de fleste av våre synaptiske markører forhøyet i AD spinalvæske. Samlet sett var disse analysene i stand til å skille statistisk signifikante trender i hjerne- og cerebrospinalvæskenivåer i hver av våre fem paneler. Disse trendene fremhever det komplekse og ofte forskjellige forholdet mellom hjerne- og CSF-proteinuttrykk i AD.
Deretter brukte vi MS-replikasjonsanalyse med høy gjennomstrømning (CSF-replikasjon 1) for å begrense vårt 271 sett med biomarkører til de mest lovende og reproduserbare målene (figur 5A). CSF-kopi 1 inneholder totalt 96 prøver fra Emory Goizueta ADRC, inkludert kontroll-, AsymAD- og AD-kohort (tabell S1A). Disse AD-tilfellene er preget av mild kognitiv nedgang (gjennomsnittlig MoCA, 20,0 ± 3,8), og endringer i AD-biomarkører bekreftet i cerebrospinalvæske (tabell S1A). I motsetning til CSF-analysen vi fant, utføres denne replikasjonen ved å bruke en mer effektiv og høyhastighets "single-shot" MS-metode (uten off-line fraksjonering), inkludert en forenklet prøveforberedelsesprotokoll som eliminerer behovet for immundeplesjon av individuelle prøver . I stedet brukes en enkelt immunutarmet "forbedringskanal" for å forsterke signalet til mindre rikelige proteiner (37). Selv om den reduserer den totale proteomdekningen, reduserer denne enkeltskuddsmetoden maskintiden betydelig og øker antallet TMT-merkede prøver som kan analyseres levedyktig (17, 38). Totalt identifiserte analysen 6487 peptider, som ble kartlagt til 1183 proteomer i 96 tilfeller. Som med CSF-analysen vi fant, ble bare de proteinene kvantifisert i minst 50 % av prøvene inkludert i de påfølgende beregningene, og dataene ble regressert for effekten av alder og kjønn. Dette førte til den endelige kvantifiseringen av 792 proteomer, hvorav 95 % også ble identifisert i CSF-datasettet som ble funnet.
(A) Hjernerelaterte CSF-proteinmål verifisert i den første replikerte CSF-kohorten og inkludert i det endelige panelet (n = 60). (B til E) Panelbiomarkørnivåer (sammensatte z-score) målt i de fire CSF-replikasjonskohortene. Sammenkoblede t-tester eller ANOVA med Tukeys etterkorreksjon ble brukt for å evaluere den statistiske signifikansen av endringene i overflod i hver replikatanalyse. CT, kontroll.
Siden vi er spesielt interessert i å verifisere våre 271 hjernerelaterte CSF-mål gjennom omfattende analyse, vil vi begrense videre undersøkelse av dette replikerte proteomet til disse markørene. Blant disse 271 proteinene ble 100 påvist i CSF-replikasjon 1. Figur S6A viser det differensielle uttrykket av disse 100 overlappende markørene mellom kontroll- og AD-replikasjonsprøvene. Synaptiske og metabolitthistoner øker mest ved AD, mens vaskulære proteiner reduseres mest ved sykdom. De fleste av de 100 overlappende markørene (n = 70) opprettholdt samme endringsretning i de to datasettene (Figur S6B). Disse 70 validerte hjernerelaterte CSF-markørene (tabell S2H) reflekterer i stor grad de tidligere observerte paneluttrykkstrendene, det vil si nedreguleringen av vaskulære proteiner og oppreguleringen av alle andre paneler. Bare 10 av disse 70 validerte proteinene viste endringer i AD-overflod som motsier disse paneltrendene. For å generere et panel som best gjenspeiler den generelle trenden til hjernen og cerebrospinalvæsken, ekskluderte vi disse 10 proteinene fra panelet av interesse som vi endelig bekreftet (Figur 5A). Derfor inkluderer panelet vårt til slutt totalt 60 proteiner verifisert i to uavhengige CSF AD-kohorter ved bruk av forskjellige prøveforberedelser og MS-plattformanalyse. Z-score-uttrykksplottene til disse siste panelene i CSF-kopi 1-kontroll- og AD-tilfellene bekreftet paneltrenden observert i CSF-kohorten vi fant (Figur 5B).
Blant disse 60 proteinene er det molekyler kjent for å være assosiert med AD, slik som osteopontin (SPP1), som er et pro-inflammatorisk cytokin som har vært assosiert med AD i mange studier (39-41), og GAP43, et synaptisk protein som er tydelig knyttet til nevrodegenerasjon (42). De mest fullstendig bekreftede proteinene er markører relatert til andre nevrodegenerative sykdommer, slik som amyotrofisk lateral sklerose (ALS) relatert superoksiddismutase 1 (SOD1) og Parkinsons sykdom relatert desakkarase (PARK7). Vi har også bekreftet at mange andre markører, som SMOC1 og hjernerik membranvedleggssignalprotein 1 (BASP1), har begrenset tidligere koblinger til nevrodegenerasjon. Det er verdt å merke seg at på grunn av deres lave totale forekomst i CSF-proteomet, er det vanskelig for oss å bruke denne høykapasitets enkeltskuddsdeteksjonsmetoden for pålitelig å oppdage MAPT og visse andre AD-relaterte proteiner (for eksempel NEFL og NRGN ) (43, 44).
Vi sjekket deretter disse 60 prioriterte panelmarkørene i tre ekstra replikatanalyser. I CSF-kopi 2 brukte vi en enkelt TMT-MS for å analysere en uavhengig kohort av 297 kontroll- og AD-prøver fra Emory Goizueta ADRC (17). CSF-replikasjon 3 inkluderte en reanalyse av tilgjengelige TMT-MS-data fra 120 kontroll- og AD-pasienter fra Lausanne, Sveits (45). Vi oppdaget mer enn to tredjedeler av de 60 prioritetsmarkørene i hvert datasett. Selv om den sveitsiske studien brukte forskjellige MS-plattformer og TMT-kvantifiseringsmetoder (45, 46), reproduserte vi paneltrendene våre sterkt i to gjentatte analyser (figur 5, C og D, og tabeller S2, I og J). For å evaluere sykdomsspesifisiteten til gruppen vår, brukte vi TMT-MS for å analysere det fjerde replikasjonsdatasettet (CSF-replikasjon 4), som inkluderte ikke bare kontroll (n = 18) og AD (n = 17) tilfeller, men også PD ( n = 14)), ALS (n = 18) og frontotemporal demens (FTD) prøver (n = 11) (tabell S1A). Vi har vellykket kvantifisert nesten to tredjedeler av panelproteinene i denne kohorten (38 av 60). Disse resultatene fremhever de AD-spesifikke endringene i alle fem biomarkørpanelene (figur 5E og tabell S2K). Økningen i metabolittgruppen viste den sterkeste AD-spesifisiteten, etterfulgt av myeliniserings- og gliagruppen. I mindre grad viser FTD også en økning mellom disse panelene, noe som kan reflektere lignende potensielle nettverksendringer (17). Derimot viste ALS og PD nesten de samme myelinerings-, glial- og metabolomprofilene som kontrollgruppen. Totalt sett, til tross for forskjeller i prøveforberedelse, MS-plattform og TMT-kvantifiseringsmetoder, viser disse gjentatte analysene at våre prioriterte panelmarkører har svært konsistente AD-spesifikke endringer i mer enn 500 unike CSF-prøver.
AD nevrodegenerasjon har vært allment anerkjent flere år før debut av kognitive symptomer, så det er et presserende behov for biomarkører for AsymAD (5, 31). Flere og flere bevis viser imidlertid at biologien til AsymAD er langt fra homogen, og det komplekse samspillet mellom risiko og resiliens fører til store individuelle forskjeller i påfølgende sykdomsprogresjon (47). Selv om de brukes til å identifisere AsymAD-tilfeller, har ikke nivåene av kjerne-CSF-biomarkører (Aβ1-42, total tau og p-tau) vist seg å være i stand til pålitelig å forutsi hvem som vil utvikle seg til demens (4, 7), noe som indikerer mer. nødvendig å inkludere holistiske biomarkørverktøy basert på flere aspekter av hjernefysiologi for å nøyaktig stratifisere risikoen for denne populasjonen. Derfor analyserte vi deretter vårt AD-validerte biomarkørpanel i AsymAD-populasjonen av CSF kopi 1. Disse 31 AsymAD-tilfellene viste unormale kjernebiomarkørnivåer (Aβ1–42/totalt tau ELISA-forhold, <5,5) og fullstendig kognisjon (gjennomsnittlig MoCA, 27,1) ± 2,2) (Tabell S1A). I tillegg har alle individer med AsymAD en klinisk demensskåre på 0, noe som indikerer at det ikke er bevis for en nedgang i daglig kognitiv eller funksjonell ytelse.
Vi analyserte først nivåene til de validerte panelene i alle 96 CSF-replikater 1, inkludert AsymAD-kohorten. Vi fant at flere paneler i AsymAD-gruppen hadde signifikante AD-lignende overflodsendringer, det vaskulære panelet viste en nedadgående trend i AsymAD, mens alle andre paneler viste en oppadgående trend (Figur 6A). Derfor viste alle paneler en svært signifikant korrelasjon med ELISA Aβ1-42 og totale tau-nivåer (Figur 6B). Derimot er korrelasjonen mellom gruppen og MoCA-skåren relativt dårlig. Et av de mer slående funnene fra disse analysene er det store utvalget av paneloverflod i AsymAD-kohorten. Som vist i figur 6A, krysser panelnivået til AsymAD-gruppen vanligvis panelnivået til kontrollgruppen og AD-gruppen, og viser relativt høy variasjon. For å utforske denne heterogeniteten til AsymAD ytterligere, brukte vi Multidimensional Scaling (MDS) analyse på 96 CSF-replikasjon 1 tilfeller. MDS-analyse gjør det mulig å visualisere likheten mellom tilfeller basert på visse variabler i datasettet. For denne klyngeanalysen bruker vi bare de validerte panelmarkørene som har en statistisk signifikant endring (P <0,05, AD/kontroll) i CSF-oppdagelsen og replikasjonen 1 proteom (n = 29) (Tabell S2L) nivå. Denne analysen ga klar romlig klynging mellom kontroll- og AD-tilfellene våre (figur 6C). Derimot er noen AsymAD-tilfeller tydelig gruppert i kontrollgruppen, mens andre er lokalisert i AD-tilfeller. For å utforske denne AsymAD-heterogeniteten ytterligere, brukte vi MDS-kartet vårt til å definere to grupper av disse AsymAD-tilfellene. Den første gruppen inkluderte AsymAD-tilfeller som var gruppert nærmere kontrollen (n = 19), mens den andre gruppen ble karakterisert av AsymAD-tilfeller med en markørprofil nærmere AD (n = 12).
(A) Ekspresjonsnivået (z-score) til CSF-biomarkørgruppen i alle 96 prøver i CSF-replikasjons 1-kohorten, inkludert AsymAD. Variansanalyse med Tukeys etterkorreksjon ble brukt for å evaluere den statistiske signifikansen av endringer i paneloverflod. (B) Korrelasjonsanalyse av panelproteinoverflodsnivå (z-score) med MoCA-score og totalt tau-nivå i ELISA Aβ1-42 og CSF kopi 1 prøver. Pearson-korrelasjonskoeffisienten med den relevante P-verdien vises. (C) MDS for 96 tilfeller av CSF kopi 1 var basert på overflodsnivåene til 29 validerte panelmarkører, som ble betydelig endret i både funn og CSF kopi 1 datasett [P <0,05 AD/kontroll (CT)]. Denne analysen ble brukt til å dele AsymAD-gruppen inn i kontroll (n = 19) og AD (n = 12) undergrupper. (D) Vulkanplottet viser det differensielle uttrykket av alle CSF-replikasjons 1-proteiner med log2-fold endring (x-aksen) i forhold til -log10 statistiske P-verdi mellom de to AsymAD-undergruppene. Panelets biomarkører er farget. (E) CSF-replikasjon 1 overflodsnivå av seleksjonsgruppens biomarkører er differensielt uttrykt mellom AsymAD-undergrupper. Tukeys postjusterte variansanalyse ble brukt for å vurdere statistisk signifikans.
Vi undersøkte det differensielle proteinuttrykket mellom disse kontroll- og AD-lignende AsymAD-tilfellene (figur 6D og tabell S2L). Det resulterende vulkankartet viser at 14 panelmarkører har endret seg betydelig mellom de to gruppene. De fleste av disse markørene er medlemmer av synapsen og metabolomet. Imidlertid tilhører SOD1 og myristoylert alaninrikt proteinkinase C-substrat (MARCKS), som er medlemmer av henholdsvis myelin- og glialimmungruppene, også til denne gruppen (figur 6, D og E). Det vaskulære panelet bidro også med to markører som ble betydelig redusert i den AD-lignende AsymAD-gruppen, inkludert AE-bindende protein 1 (AEBP1) og komplementfamiliemedlem C9. Det var ingen signifikant forskjell mellom kontroll- og AD-lignende AsymAD-undergrupper i ELISA AB1-42 (P = 0,38) og p-tau (P = 0,28), men det var faktisk en signifikant forskjell i det totale tau-nivået (P = 0,0031) ) (Fig. S7). Det er flere panelmarkører som indikerer at endringene mellom de to AsymAD-undergruppene er mer signifikante enn de totale tau-nivåene (for eksempel YWHAZ, SOD1 og MDH1) (Figur 6E). Samlet sett indikerer disse resultatene at vårt validerte panel kan inneholde biomarkører som kan undertype og potensiell risikostratifisering av pasienter med asymptomatisk sykdom.
Det er et presserende behov for systembaserte biomarkørverktøy for å bedre måle og målrette de ulike patofysiologiene bak AD. Disse verktøyene forventes ikke bare å endre vårt diagnostiske rammeverk for AD, men også fremme bruken av effektive, pasientspesifikke behandlingsstrategier (1, 2). For dette formål brukte vi en objektiv, omfattende proteomikk-tilnærming til AD-hjerne og CSF for å identifisere nettbaserte CSF-biomarkører som reflekterer et bredt spekter av hjernebasert patofysiologi. Vår analyse produserte fem CSF-biomarkørpaneler, som (i) reflekterer synapser, blodkar, myelin, immun- og metabolsk dysfunksjon; (ii) demonstrere sterk reproduserbarhet på forskjellige MS-plattformer; (iii) Vis progressive sykdomsspesifikke endringer gjennom de tidlige og sene stadiene av AD. Samlet sett representerer disse funnene et lovende skritt mot utviklingen av mangfoldige, pålitelige, nettorienterte biomarkørverktøy for AD-forskning og kliniske applikasjoner.
Resultatene våre viser den svært bevarte organiseringen av AD-hjernenettverksproteomet og støtter bruken av det som et anker for systembasert biomarkørutvikling. Vår analyse viser at to uavhengige TMT-MS-datasett som inneholder AD- og AsymAD-hjerner har sterk modularitet. Disse funnene utvider vårt tidligere arbeid, og demonstrerer bevaringen av de kraftige modulene av mer enn 2000 hjernevev fra flere uavhengige kohorter i frontal, parietal og temporal cortex (17). Dette konsensusnettverket gjenspeiler forskjellige sykdomsrelaterte endringer observert i nåværende forskning, inkludert økningen av glialrike inflammatoriske moduler og reduksjonen av nevronrike moduler. I likhet med dagens forskning har dette storskala nettverket også betydelige modulære endringer i AsymAD, som viser en rekke forskjellige prekliniske patofysiologi (17).
Innenfor dette svært konservative systembaserte rammeverket er det imidlertid mer finkornet biologisk heterogenitet, spesielt blant individer i de tidlige stadiene av AD. Vårt biomarkørpanel er i stand til å skildre to undergrupper i AsymAD, som demonstrerer det betydelige differensielle uttrykket av flere CSF-markører. Vår gruppe var i stand til å fremheve de biologiske forskjellene mellom disse to undergruppene, som ikke var åpenbare på nivået av kjerne AD-biomarkører. Sammenlignet med kontrollgruppen var Aβ1-42/total tau-forhold for disse AsymAD-individene unormalt lave. Imidlertid var bare de totale tau-nivåene signifikant forskjellige mellom de to AsymAD-undergruppene, mens Aβ1-42- og p-tau-nivåene forble relativt sammenlignbare. Siden høy CSF-tau ser ut til å være en bedre prediktor for kognitive symptomer enn Aβ1-42-nivåer (7), mistenker vi at de to AsymAD-kohortene kan ha ulik risiko for sykdomsprogresjon. Gitt den begrensede prøvestørrelsen til vår AsymAD og mangelen på longitudinelle data, er ytterligere forskning nødvendig for å trekke disse konklusjonene med trygghet. Disse resultatene indikerer imidlertid at et systembasert CSF-panel kan forbedre vår evne til å effektivt stratifisere individer i det asymptomatiske stadiet av sykdommen.
Samlet sett støtter funnene våre rollen til flere biologiske funksjoner i patogenesen av AD. Imidlertid ble uregulert energimetabolisme det fremtredende temaet for alle våre fem validerte merkepaneler. Metabolske proteiner, som hypoxanthin-guanine-fosforibosyltransferase 1 (HPRT1) og laktatdehydrogenase A (LDHA), er de mest robust validerte synaptiske biomarkørene, noe som indikerer at økningen i AD CSF er svært reproduserbar sex. Våre blodårer og gliapaneler inneholder også flere markører involvert i metabolismen av oksidative stoffer. Disse funnene stemmer overens med nøkkelrollen som metabolske prosesser spiller i hele hjernen, ikke bare for å møte det høye energibehovet til nevroner, men også for å møte det høye energibehovet til astrocytter og andre gliaceller (17, 48). Resultatene våre støtter økende bevis på at endringer i redokspotensial og avbrudd av energiveier kan være kjernekoblingen mellom flere nøkkelprosesser involvert i patogenesen av AD, inkludert mitokondrielle lidelser, glialmediert betennelse og vaskulær skade (49). I tillegg inneholder de metabolske cerebrospinalvæskebiomarkørene et stort antall differensielt rike proteiner mellom våre kontroll- og AD-lignende AsymAD-undergrupper, noe som antyder at forstyrrelsen av disse energi- og redoksveiene kan være kritisk i det prekliniske stadiet av sykdommen.
De forskjellige trendene i hjerne- og cerebrospinalvæskepanelet vi har observert har også interessante biologiske implikasjoner. Synapser og metabolomer rike på nevroner viser reduserte nivåer i AD-hjernen og økt overflod av cerebrospinalvæske. Gitt at nevroner er rike på energiproduserende mitokondrier ved synapser for å gi energi til deres mange spesialiserte signaler (50), forventes likheten mellom uttrykksprofilene til disse to nevrongruppene. Tap av nevroner og ekstrudering av skadede celler kan forklare disse hjerne- og CSF-paneltrendene ved senere sykdom, men de kan ikke forklare de tidlige panelendringene vi observerer (13). En mulig forklaring på disse funnene ved tidlig asymptomatisk sykdom er unormal synaptisk beskjæring. Nye bevis i musemodeller tyder på at mikroglia-mediert synaptisk fagocytose kan være unormalt aktivert i AD og føre til tidlig synapsetap i hjernen (51). Dette kasserte synaptiske materialet kan samle seg i CSF, og det er derfor vi observerer økningen i CSF i nevronpanelet. Immunmediert synaptisk beskjæring kan også delvis forklare økningen i gliaproteiner vi observerer i hjernen og cerebrospinalvæsken gjennom sykdomsprosessen. I tillegg til synaptisk beskjæring, kan generelle abnormiteter i den eksocytiske banen også føre til forskjellige hjerne- og CSF-uttrykk av nevronale markører. En rekke studier har vist at innholdet av eksosomer i patogenesen til AD hjerne har endret seg (52). Den ekstracellulære banen er også involvert i spredningen av Aβ (53, 54). Det er verdt å merke seg at undertrykkelse av eksosomal sekresjon kan redusere AD-lignende patologi i AD transgene musemodeller (55).
Samtidig viste proteinet i det vaskulære panelet en moderat økning i AD-hjernen, men signifikant redusert i CSF. Blod-hjernebarrieren (BBB) dysfunksjon kan delvis forklare disse funnene. Mange uavhengige postmortem humane studier har vist BBB-nedbrytning i AD (56, 57). Disse studiene bekreftet ulike unormale aktiviteter rundt dette tett forseglede laget av endotelceller, inkludert hjernekapillærlekkasje og perivaskulær akkumulering av blodbårne proteiner (57). Dette kan gi en enkel forklaring på de forhøyede vaskulære proteinene i hjernen, men det kan ikke helt forklare uttømmingen av disse samme proteinene i cerebrospinalvæsken. En mulighet er at sentralnervesystemet aktivt isolerer disse molekylene for å løse problemet med økt betennelse og oksidativt stress. Reduksjonen i noen av de mest alvorlige CSF-proteinene i dette panelet, spesielt de som er involvert i lipoproteinregulering, er relatert til hemming av skadelige nivåer av betennelse og den nevrobeskyttende prosessen til reaktive oksygenarter. Dette gjelder for Paroxonase 1 (PON1), et lipoproteinbindende enzym som er ansvarlig for å redusere oksidativt stressnivå i sirkulasjonen (58, 59). Alfa-1-mikroglobulin/bikunin forløper (AMBP) er en annen betydelig nedregulert markør for den vaskulære gruppen. Det er forløperen til lipidtransportøren bikunin, som også er involvert i betennelsesundertrykkelse og nevrologisk beskyttelse (60, 61).
Til tross for forskjellige interessante hypoteser, er manglende evne til direkte å oppdage biokjemiske sykdomsmekanismer en velkjent begrensning for oppdagelsesdrevet proteomikkanalyse. Derfor er ytterligere forskning nødvendig for å trygt definere mekanismene bak disse biomarkørpanelene. For å bevege seg mot utviklingen av MS-basert klinisk analyse, krever den fremtidige retningen også bruk av målrettede kvantitative metoder for storskala biomarkørverifisering, som selektiv eller parallell reaksjonsovervåking (62). Vi brukte nylig parallell reaksjonsovervåking (63) for å validere mange av CSF-proteinendringene beskrevet her. Flere prioriterte panelmål er kvantifisert med betydelig nøyaktighet, inkludert YWHAZ, ALDOA og SMOC1, som kartlegger til henholdsvis synapse-, metabolisme- og betennelsespanelene våre (63). Uavhengig datainnsamling (DIA) og andre MS-baserte strategier kan også være nyttige for målverifisering. Bud et al. (64) Det ble nylig påvist at det er en betydelig overlapping mellom AD-biomarkørene identifisert i vårt CSF-funndatasett og det uavhengige DIA-MS-datasettet, som består av nesten 200 CSF-prøver fra tre forskjellige europeiske kohorter. Disse nylige studiene støtter potensialet til panelene våre til å forvandle seg til pålitelig MS-basert deteksjon. Tradisjonell antistoff- og aptamer-basert påvisning er også viktig for videreutvikling av sentrale AD-biomarkører. På grunn av den lave forekomsten av CSF, er det vanskeligere å oppdage disse biomarkørene ved å bruke MS-metoder med høy gjennomstrømning. NEFL og NRGN er to slike eksempler på lav-forekomst CSF-biomarkører, som er kartlagt til panelet i vår omfattende analyse, men som ikke kan oppdages pålitelig ved å bruke vår enkelt MS-strategi. Målrettingsstrategier basert på flere antistoffer, slik som PEA, kan fremme den kliniske transformasjonen av disse markørene.
Totalt sett gir denne studien en unik proteomikk-tilnærming for identifisering og verifisering av CSF AD-biomarkører basert på forskjellige systemer. Å optimalisere disse markørpanelene på tvers av flere AD-kohorter og MS-plattformer kan vise seg å være lovende for å fremme AD-risikostratifisering og behandling. Studier som evaluerer det langsgående nivået til disse panelene over tid er også kritiske for å bestemme hvilken kombinasjon av markører som best stratifiserer risikoen for tidlig sykdom og endringer i sykdommens alvorlighetsgrad.
Bortsett fra de 3 prøvene kopiert av CSF, ble alle CSF-prøver brukt i denne studien samlet inn i regi av Emory ADRC eller nært beslektede forskningsinstitusjoner. Totalt fire sett med Emory CSF-prøver ble brukt i disse proteomikkstudiene. CSF-kohorten ble funnet å inneholde prøver fra 20 friske kontroller og 20 AD-pasienter. CSF-kopi 1 inkluderer prøver fra 32 friske kontroller, 31 AsymAD-individer og 33 AD-individer. CSF kopi 2 inneholder 147 kontroller og 150 AD prøver. Multi-sykdom CSF replikasjon 4 kohorten inkluderte 18 kontroller, 17 AD, 19 ALS, 13 PD og 11 FTD prøver. I henhold til avtalen godkjent av Emory University Institutional Review Board, fikk alle deltakere i Emory-studien informert samtykke. I henhold til 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimers Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), ble cerebrospinalvæske samlet inn og lagret ved lumbalpunksjon. Kontroll- og AsymAD- og AD-pasienter mottok standardisert kognitiv vurdering ved Emory Cognitive Neurology Clinic eller Goizueta ADRC. Deres cerebrospinalvæskeprøver ble testet av INNO-BIA AlzBio3 Luminex for ELISA Aβ1-42, total tau og p-tau analyse (65). ELISA-verdier brukes for å støtte diagnostisk klassifisering av forsøkspersoner basert på etablerte AD biomarkør cut-off kriterier (66, 67). Grunnleggende demografiske og diagnostiske data for andre CSF-diagnoser (FTD, ALS og PD) er også innhentet fra Emory ADRC eller tilknyttede forskningsinstitusjoner. Oppsummeringsmetadataene for disse Emory CSF-tilfellene finnes i tabell S1A. Egenskapene til den sveitsiske CSF-replikasjons 3-kohorten er tidligere publisert (45).
CSF fant prøven. For å øke dybden av vår oppdagelse av CSF-datasettet, ble immunforbruk av proteiner med høy overflod utført før trypsinisering. Kort fortalt ble 130 μl CSF fra 40 individuelle CSF-prøver og et likt volum (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) plassert i en spinnkolonne (Thermo Fisher Scientific, A89868) i rommet temperatur Inkuber). Etter sentrifugering i 15 minutter, sentrifuger prøven ved 1000g i 2 minutter. En 3K ultrasentrifugalfilteranordning (Millipore, UFC500396) ble brukt til å konsentrere avløpsprøven ved sentrifugering ved 14 000 g i 30 minutter. Fortynn alle prøvevolumer til 75 μl med fosfatbufret saltvann. Proteinkonsentrasjonen ble evaluert ved hjelp av bicinchoninsyre (BCA)-metoden i henhold til produsentens protokoll (Thermo Fisher Scientific). Den immundepleterte CSF (60 μl) fra alle 40 prøvene ble fordøyd med lysylendopeptidase (LysC) og trypsin. Kort fortalt ble prøven redusert og alkylert med 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboksyetyl)-fosfin og 3 μl 0,8 M kloracetamid ved 90°C i 10 minutter, og deretter sonikert i vannbad i 15 minutter. Prøven ble fortynnet med 193 μl 8 M ureabuffer [8 M urea og 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] til en sluttkonsentrasjon på 6 M urea. LysC (4,5 μg; Wako) brukes til fordøyelse over natten ved romtemperatur. Prøven ble deretter fortynnet til 1 M urea med 50 mM ammoniumbikarbonat (ABC) (68). Tilsett en lik mengde (4,5 μg) trypsin (Promega), og inkuber deretter prøven i 12 timer. Surgjør den fordøyde peptidløsningen til en sluttkonsentrasjon på 1 % maursyre (FA) og 0,1 % trifluoreddiksyre (TFA) (66), og avsaltes deretter med en 50 mg Sep-Pak C18-kolonne (Waters) som beskrevet ovenfor (25) . Peptidet ble deretter eluert i 1 ml 50 % acetonitril (ACN). For å standardisere proteinkvantifisering på tvers av batcher (25), ble 100 μl alikvoter fra alle 40 CSF-prøver kombinert for å generere en blandet prøve, som deretter ble delt inn i fem global intern standard (GIS) (48) prøver. Alle individuelle prøver og kombinerte standarder tørkes med høyhastighetsvakuum (Labconco).
CSF kopierer prøven. Dayon og kolleger har tidligere beskrevet immundeplesjon og fordøyelse av CSF kopi 3 prøver (45, 46). De gjenværende replikatprøvene var ikke individuelt immundepletert. Fordøy disse ikke-fjernede prøvene i trypsin som beskrevet tidligere (17). For hver gjentatt analyse ble 120 μl aliquoter av det eluerte peptidet fra hver prøve slått sammen og delt i like volum aliquoter for å brukes som den TMT-merkede globale interne standarden (48). Alle individuelle prøver og kombinerte standarder tørkes med høyhastighetsvakuum (Labconco). For å forsterke signalet til CSF-proteinet med lav overflod, ved å kombinere 125 μl fra hver prøve, ble det utarbeidet en "forbedret" prøve for hver replikatanalyse [dvs. en biologisk prøve som etterligner forskningsprøven, men mengden tilgjengelig er mye større (37, 69)] slått sammen til en blandet CSF-prøve (17). Den blandede prøven ble deretter immunfjernet ved bruk av 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), fordøyd som beskrevet ovenfor, og inkludert i den påfølgende multiple TMT-merkingen.
Innleggstid: 27. august 2021