Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Termofile er mikroorganismer som trives ved høye temperaturer. Å studere dem kan gi verdifull informasjon om hvordan livet tilpasser seg ekstreme forhold. Det er imidlertid vanskelig å oppnå høye temperaturforhold med konvensjonelle optiske mikroskoper. Det er foreslått flere hjemmelagde løsninger basert på lokal resistiv elektrisk oppvarming, men det finnes ingen enkel kommersiell løsning. I denne artikkelen introduserer vi konseptet med mikroskala laseroppvarming over mikroskopets synsfelt for å gi høye temperaturer for termofile studier samtidig som brukerens miljø holdes mildt. Oppvarming i mikroskala ved moderat laserintensitet kan oppnås ved å bruke et gull nanopartikkelbelagt substrat som en biokompatibel og effektiv lysabsorber. Mulige effekter av væskekonveksjon i mikroskala, celletensjon og sentrifugal termoforetisk bevegelse blir diskutert. Metoden er demonstrert i to arter: (i) Geobacillus stearothermophilus, en aktiv termofil bakterie som formerer seg ved ca. 65°C, som vi har observert spirer, vokser og svømmer under oppvarming i mikroskala; (ii) Thiobacillus sp., en optimalt hypertermofil arkea. ved 80°C. Dette arbeidet baner vei for enkel og sikker observasjon av termofile mikroorganismer ved hjelp av moderne og rimelige mikroskopiverktøy.
I løpet av milliarder av år har livet på jorden utviklet seg til å tilpasse seg et bredt spekter av miljøforhold som noen ganger anses som ekstreme fra vårt menneskelige perspektiv. Spesielt noen termofile mikroorganismer (bakterier, archaea, sopp) kalt termofile trives i temperaturområdet fra 45°C til 122°C1, 2, 3, 4. Termofile lever i ulike økosystemer, som hydrotermiske ventiler i dyphavet, varme kilder eller vulkanske områder. Forskningen deres har skapt stor interesse de siste tiårene av minst to grunner. For det første kan vi lære av dem, for eksempel hvordan termofile 5, 6, enzymer 7, 8 og membraner 9 er stabile ved så høye temperaturer, eller hvordan termofile kan tåle ekstreme nivåer av stråling10. For det andre er de grunnlaget for mange viktige bioteknologiske anvendelser1,11,12 som drivstoffproduksjon13,14,15,16, kjemisk syntese (dihydro, alkoholer, metan, aminosyrer, etc.)17, biogruvedrift18 og termostabile biokatalysatorer7 ,11, 13. Spesielt involverer den for tiden velkjente polymerasekjedereaksjonen (PCR)19 et enzym (Taq polymerase) isolert fra den termofile bakterien Thermus aquaticus, en av de første termofile som ble oppdaget.
Studiet av termofile er imidlertid ikke en lett oppgave og kan ikke improviseres i noe biologisk laboratorium. Spesielt kan levende termofile ikke observeres in vitro med et standard lysmikroskop, selv med kommersielt tilgjengelige varmekamre, vanligvis vurdert for temperaturer så lave som 40 °C. Siden 1990-tallet har bare noen få forskningsgrupper dedikert seg til innføringen av høytemperaturmikroskopi (HTM) systemer. I 1994 ble Glukh et al. Oppvarmings-/kjølekammeret ble unnfanget basert på bruk av en Peltier-celle som kontrollerer temperaturen på rektangulære kapillærer lukket for å opprettholde anaerobitet 20 . Enheten kan varmes opp til 100 °C med en hastighet på 2 °C/s, slik at forfatterne kan studere motiliteten til den hypertermofile bakterien Thermotoga maritima21. I 1999, Horn et al. En svært lik enhet er utviklet, fortsatt basert på bruk av oppvarmede kapillærer egnet for kommersiell mikroskopi for å studere celledeling/forbindelse. Etter en lang periode med relativ inaktivitet ble søket etter effektive HTM-er gjenopptatt i 2012, spesielt i forbindelse med en serie artikler fra Wirth-gruppen som brukte en enhet oppfunnet av Horn et al. For 15 år siden ble bevegeligheten til et stort antall arkea, inkludert hypertermofiler, studert ved temperaturer opp til 100°C ved bruk av oppvarmede kapillærer23,24. De modifiserte også det originale mikroskopet for å oppnå raskere oppvarming (flere minutter i stedet for 35 minutter for å nå den innstilte temperaturen) og oppnå en lineær temperaturgradient på mer enn 2 cm over mediet. Denne temperaturgradientformingsenheten (TGFD) har blitt brukt til å studere mobiliteten til mange termofile innenfor temperaturgradienter ved biologisk relevante avstander 24, 25.
Oppvarming av lukkede kapillærer er ikke den eneste måten å observere levende termofile. I 2012, Kuwabara et al. Hjemmelagde engangs Pyrex-kamre forseglet med varmebestandig lim (Super X2; Cemedine, Japan) ble brukt. Prøvene ble plassert på en kommersielt tilgjengelig gjennomsiktig varmeplate (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) som var i stand til å varme opp til 110°C, men ikke opprinnelig ment for bioavbildning. Forfatterne observerte effektiv deling av anaerobe termofile bakterier (Thermosipho globiformans, doblingstid 24 min) ved 65°C. I 2020, Pulshen et al. Effektiv oppvarming av kommersielle metallskåler (AttofluorTM, Thermofisher) ble demonstrert ved bruk av to hjemmelagde varmeelementer: et lokk og en scene (PCR-maskininspirert konfigurasjon). Denne assosiasjonen resulterer i en jevn væsketemperatur og forhindrer fordampning og kondens i bunnen av lokket. Bruken av en O-ring unngår gassutveksling med miljøet. Denne HTM, kalt Sulfoscope, ble brukt til å avbilde Sulfolobus acidocaldarius ved 75°C27.
En anerkjent begrensning for alle disse systemene var begrensningen til bruk av luftmål, idet enhver oljenedsenking var uegnet for så høye temperaturer og for avbildning gjennom >1 mm tykke gjennomsiktige prøver. En anerkjent begrensning for alle disse systemene var begrensningen til bruk av luftmål, idet enhver oljenedsenking var uegnet for så høye temperaturer og for avbildning gjennom >1 mm tykke gjennomsiktige prøver. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объектив, кобъектив е погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачнцы обрачные >. En erkjent mangel ved alle disse systemene var begrensningen til bruk av luftmål, siden enhver oljenedsenking ikke var egnet for så høye temperaturer og for visualisering gjennom transparente prøver > 1 mm tykke.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都限制是限制使用空气物镜，任何油浸都业适合踄口毫米厚的透明样品成像。 En anerkjent begrensning for alle disse systemene er begrensningen ved bruk av et luftinnført speil, da enhver oljenedsenking er uegnet for å avbilde transparente prøver > 1 mm tykke ved så høye temperaturer. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объектин ружение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы мобразци мой с 1. En anerkjent ulempe med alle disse systemene er den begrensede bruken av luftlinser, enhver oljenedsenking er uegnet for så høye temperaturer og visualisering gjennom transparente prøver >1 mm tykke.Mer nylig ble denne begrensningen opphevet av Charles-Orzag et al. 28, som utviklet en enhet som ikke lenger gir varme rundt systemet av interesse, men heller inne i selve dekkglasset, dekket med et tynt gjennomsiktig lag av en motstand laget av ITO (indium-tinnoksid). Lokket kan varmes opp til 75 °C ved å føre en elektrisk strøm gjennom det transparente laget. Forfatteren må imidlertid også varme linsen til objektivet, men ikke mer enn 65 °C, for ikke å skade den.
Disse arbeidene viser at utviklingen av effektiv høytemperatur optisk mikroskopi ikke har blitt tatt i bruk, ofte krever hjemmelaget utstyr og ofte oppnås på bekostning av romlig oppløsning, noe som er en alvorlig ulempe gitt at termofile mikroorganismer ikke er større enn noen få. mikrometer. Redusert oppvarmingsvolum er nøkkelen til å løse tre iboende problemer med HTM: dårlig romlig oppløsning, høy termisk treghet når systemet varmes opp, og skadelig oppvarming av omkringliggende elementer (senkeolje, objektivlinse ... eller brukerens hender) ved ekstreme temperaturer. ).
I denne artikkelen introduserer vi en HTM for termofil observasjon som ikke er basert på resistiv oppvarming. I stedet oppnådde vi lokalisert oppvarming innenfor et begrenset område av mikroskopets synsfelt ved laserbestråling av et lysabsorberende underlag. Temperaturfordelingen ble visualisert ved bruk av kvantitativ fasemikroskopi (QPM). Effektiviteten til denne metoden demonstreres av Geobacillus stearothermophilus, en bevegelig termofil bakterie som reproduserer ved ca. 65°C og har en kort doblingstid (ca. 20 minutter), og Sulfolobus shibatae, en hypertermofil som vokser optimalt ved 80°C (archaea) å illustrere. Normal replikasjonshastighet og svømming ble observert som en funksjon av temperaturen. Denne laseren HTM (LA-HTM) er ikke begrenset av tykkelsen på dekkglasset eller av objektivets natur (luft- eller oljenedsenking). Dette gjør at alle høyoppløselige objektiver på markedet kan brukes. Den lider heller ikke av langsom oppvarming på grunn av termisk treghet (oppnår øyeblikkelig oppvarming på millisekundskala) og bruker kun kommersielt tilgjengelige komponenter. De eneste nye sikkerhetsproblemene er knyttet til tilstedeværelsen av kraftige laserstråler (vanligvis opptil 100 mW) inne i enheten og muligens gjennom øynene, som krever beskyttelsesbriller.
Prinsippet til LA-HTM er å bruke en laser for å varme opp prøven lokalt innenfor synsfeltet til mikroskopet (fig. 1a). For å gjøre dette må prøven være lysabsorberende. For å bruke en rimelig lasereffekt (mindre enn 100 mW), stolte vi ikke på absorpsjonen av lys av det flytende mediet, men økte absorpsjonen av prøven kunstig ved å belegge underlaget med gullnanopartikler (fig. 1c). Oppvarming av gullnanopartikler med lys er av grunnleggende betydning for feltet termisk plasmonikk, med forventede anvendelser innen biomedisin, nanokjemi eller høsting av sollys29,30,31. I løpet av de siste årene har vi brukt denne LA-HTM i flere studier relatert til termiske plasmaapplikasjoner innen fysikk, kjemi og biologi. Den største vanskeligheten med denne metoden er å vise den endelige temperaturprofilen, siden den forhøyede temperaturen er begrenset til et mikroskalaområde i prøven. Vi har vist at temperaturkartlegging kan oppnås med fire-bølgelengdes tverrskjær-interferometer, en enkel, høyoppløselig og svært følsom metode for kvantitativ fasemikroskopi basert på bruk av todimensjonale diffraksjonsgitter (også kjent som kryssgitter) 33,34,35,36. Påliteligheten til denne termiske mikroskopiteknikken, basert på kryssgitterbølgefrontmikroskopi (CGM), har blitt demonstrert i et dusin artikler publisert i løpet av det siste tiåret37,38,39,40,41,42,43.
Opplegg for installasjon av parallell laseroppvarming, forming og temperaturmikroskop. b Prøvegeometri bestående av et AttofluorTM-kammer som inneholder et dekkglass belagt med gullnanopartikler. c Se nøye på prøven (ikke i skala). d representerer den ensartede laserstråleprofilen og (e) den simulerte påfølgende temperaturfordelingen på prøveplanet til gullnanopartikler. f er en ringformet laserstråleprofil egnet for å generere en jevn temperatur som vist i simuleringen av den resulterende temperaturfordelingen vist i (g). Målestokk: 30 µm.
Spesielt oppnådde vi nylig oppvarming av pattedyrceller med LA-HTM og CGM og sporet cellulære varmesjokkresponser i området 37-42 °C, noe som demonstrerer anvendeligheten av denne teknikken på enkeltlevende celleavbildning. Anvendelsen av LA-HTM til studiet av mikroorganismer ved høye temperaturer er imidlertid ikke entydig, siden den krever mer forsiktighet sammenlignet med pattedyrceller: For det første fører oppvarming av bunnen av mediet med titalls grader (i stedet for noen få grader) til en sterk vertikal temperaturgradient. kan skape væskekonveksjon 44 som, hvis den ikke er fast festet til underlaget, kan forårsake uønsket bevegelse og blanding av bakterier. Denne konveksjonen kan elimineres ved å redusere tykkelsen på væskelaget. For dette formålet, i alle eksperimentene presentert nedenfor, ble bakteriesuspensjoner plassert mellom to dekkglass ca. 15 µm tykke plassert inne i en metallkopp (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). I prinsippet kan konveksjon unngås hvis tykkelsen på væsken er mindre enn strålestørrelsen til varmelaseren. For det andre kan arbeid i en så begrenset geometri kvele aerobe organismer (se fig. S2). Dette problemet kan unngås ved å bruke et substrat som er permeabelt for oksygen (eller annen vital gass), ved å etterlate innestengte luftbobler inne i dekkglasset, eller ved å bore hull i det øverste dekkglasset (se Fig. S1) 45 . I denne studien valgte vi sistnevnte løsning (figur 1b og S1). Endelig gir ikke laseroppvarming jevn temperaturfordeling. Selv ved samme intensitet av laserstrålen (fig. 1d), er temperaturfordelingen ikke jevn, men ligner heller Gauss-fordelingen på grunn av termisk diffusjon (fig. 1e). Når målet er å etablere presise temperaturer i synsfeltet for å studere biologiske systemer, er ujevne profiler ikke ideelle og kan også føre til termoforetisk bevegelse av bakterier dersom de ikke fester seg til underlaget (se fig. S3, S4)39. For dette formål brukte vi en romlig lysmodulator (SLM) for å forme den infrarøde laserstrålen i henhold til formen på ringen (fig. 1f) i prøveplanet for å oppnå en perfekt jevn temperaturfordeling innenfor et gitt geometrisk område, til tross for termisk diffusjon (fig. 1d) 39, 42, 46. Legg et dekkglass over en metallskål (figur 1b) for å unngå fordampning av mediet og observer i minst noen få dager. Fordi dette toppdekselglasset ikke er forseglet, kan ekstra medium enkelt legges til når som helst om nødvendig.
For å illustrere hvordan LA-HTM fungerer og demonstrere dens anvendelighet i termofil forskning, studerte vi de aerobe bakteriene Geobacillus stearothermophilus, som har en optimal veksttemperatur på rundt 60-65°C. Bakterien har også flageller og evnen til å svømme, noe som gir en annen indikator på normal cellulær aktivitet.
Prøver (fig. 1b) ble pre-inkubert ved 60°C i én time og deretter plassert i en LA-HTM prøveholder. Denne pre-inkubasjonen er valgfri, men fortsatt nyttig, av to grunner: For det første, når laseren slås på, får det cellene til å vokse og dele seg umiddelbart (se film M1 i Supplementary Materials). Uten pre-inkubasjon blir bakterieveksten typisk forsinket med ca. 40 minutter hver gang et nytt visningsområde varmes opp på prøven. For det andre fremmet 1 times pre-inkubering adhesjon av bakteriene til dekkglasset, og forhindret cellene i å drive ut av synsfeltet på grunn av termoforese når laseren ble slått på (se film M2 i Supplementary Materials). Termoforese er bevegelsen av partikler eller molekyler langs en temperaturgradient, vanligvis fra varmt til kaldt, og bakterier er intet unntak43,47. Denne uønskede effekten elimineres over et gitt område ved å bruke SLM til å forme laserstrålen og oppnå en flat temperaturfordeling.
På fig. Figur 2 viser temperaturfordelingen målt med CGM oppnådd ved å bestråle et glasssubstrat belagt med gullnanopartikler med en ringformet laserstråle (fig. 1f). En flat temperaturfordeling ble observert over hele området dekket av laserstrålen. Denne sonen ble satt til 65°C, den optimale veksttemperaturen. Utenfor dette området faller temperaturkurven naturlig til \(1/r\) (der \(r\) er den radielle koordinaten).
et temperaturkart over CGM-målinger oppnådd ved å bruke en ringformet laserstråle for å bestråle et lag med gullnanopartikler for å oppnå en flat temperaturprofil over et sirkulært område. b Isoterm av temperaturkartet (a). Konturen til laserstrålen er representert av en grå stiplet sirkel. Eksperimentet ble gjentatt to ganger (se tilleggsmaterialer, figur S4).
Levedyktigheten til bakterieceller ble overvåket i flere timer ved bruk av LA-HTM. På fig. 3 viser tidsintervallet for fire bilder tatt fra en 3 timers og 20 minutters film (Movie M3, tilleggsinformasjon). Bakterier ble observert å aktivt proliferere innenfor det sirkulære området definert av laseren der temperaturen var optimal, og nærmet seg 65 °C. Derimot ble celleveksten betydelig redusert når temperaturen falt under 50°C i 10 s.
Optiske dybdebilder av G. stearothermophilus-bakterier som vokser etter laseroppvarming til forskjellige tider, (a) t = 0 min, (b) 1 t 10 min, (c) 2 t 20 min, (d) 3 t 20 min, ut av 200 Ekstrahert fra en ett-minutters film (M3-film gitt i tilleggsinformasjon) lagt over det tilsvarende temperaturkartet. Laseren slås på ved tidspunktet \(t=0\). Isotermer er lagt til intensitetsbildet.
For ytterligere å kvantifisere cellevekst og dens avhengighet av temperatur, målte vi økningen i biomasse av forskjellige kolonier av opprinnelig isolerte bakterier i Movie M3 synsfelt (fig. 4). Foreldrebakteriene valgt ved starten av dannelsen av minikolonidannende enhet (mCFU) er vist i figur S6. Tørrmassemålinger ble tatt med et CGM 48 kamera som ble brukt til å kartlegge temperaturfordelingen. CGM-ens evne til å måle tørrvekt og temperatur er styrken til LA-HTM. Som forventet ga høy temperatur raskere bakterievekst (fig. 4a). Som vist i semi-log plottet i fig. 4b, følger vekst ved alle temperaturer eksponentiell vekst, der dataene bruker eksponentialfunksjonen \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), hvor \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – generasjonstid (eller doblingstid), \( g =1/ \tau\) – vekstrate (antall divisjoner per tidsenhet ). På fig. 4c viser den respektive veksthastighet og generasjonstid som funksjon av temperatur. Hurtigvoksende mCFUer er preget av metning av vekst etter to timer, en forventet oppførsel på grunn av høy bakterietetthet (ligner på den stasjonære fasen i klassiske flytende kulturer). Den generelle formen \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) tilsvarer forventet tofasekurve for G. stearothermophilus med en optimal veksthastighet rundt 60-65°C. Match dataene ved å bruke en kardinalmodell (Figur S5)49 hvor \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, som stemmer godt overens med andre verdier sitert i litteraturen49. Selv om de temperaturavhengige parameterne er reproduserbare, kan den maksimale veksthastigheten på \({G}_{0}\) variere fra ett eksperiment til et annet (se figurene S7-S9 og film M4). I motsetning til temperaturtilpasningsparametere, som bør være universelle, avhenger maksimal veksthastighet av mediets egenskaper (tilgjengelighet av næringsstoffer, oksygenkonsentrasjon) innenfor den observerte mikroskala-geometrien.
a Mikrobiell vekst ved forskjellige temperaturer. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Data hentet fra en video av en enkelt bakterie som vokser i en temperaturgradient (film M3). b Samme som (a), semi-logaritmisk skala. c Veksthastighet\(\tau\) og generasjonstid\(g\) beregnet fra lineær regresjon (b). Horisontale feilstreker: temperaturområde over hvilke mCFU-er utvidet seg til synsfeltet under vekst. Vertikale feillinjer: standardfeil for lineær regresjon.
I tillegg til normal vekst, fløt noen bakterier noen ganger til syne under laseroppvarming, som er en forventet oppførsel for bakterier med flageller. Filmen M5 i tilleggsinformasjon viser slike svømmeaktiviteter. I dette eksperimentet ble ensartet laserstråling brukt for å lage en temperaturgradient, som vist i figurene 1d, e og S3. Figur 5 viser to bildesekvenser valgt fra M5-filmen som viser at en bakterie viser retningsbevegelse mens alle andre bakterier forblir ubevegelige.
De to tidsrammene (a) og (b) viser svømming av to forskjellige bakterier merket med stiplede sirkler. Bildene ble hentet fra M5-filmen (levert som tilleggsmateriale).
I tilfellet med G. stearothermophilus begynte den aktive bevegelsen av bakterier (fig. 5) noen sekunder etter at laserstrålen ble slått på. Denne observasjonen understreker den tidsmessige responsen til denne termofile mikroorganismen på en økning i temperatur, som allerede observert av Mora et al. 24. Temaet bakteriell motilitet og til og med termotaxis kan utforskes videre ved hjelp av LA-HTM.
Mikrobiell svømming bør ikke forveksles med andre typer fysiske bevegelser, nemlig (i) Brownsk bevegelse, som ser ut til å være kaotisk bevegelse uten bestemt retning, (ii) konveksjon 50 og termoforese 43, bestående av en regelmessig drift av bevegelse langs en temperatur gradient.
G. stearothermophilus er kjent for sin evne til å produsere svært resistente sporer (sporedannelse) når de utsettes for ugunstige miljøforhold som forsvar. Når miljøforholdene igjen blir gunstige, spirer sporene, danner levende celler og gjenopptar veksten. Selv om denne sporulerings-/spiringsprosessen er velkjent, har den aldri blitt observert i sanntid. Ved å bruke LA-HTM rapporterer vi her den første observasjonen av spiringshendelser i G. stearothermophilus.
På fig. 6a viser time-lapse-bilder av optisk dybde (OT) oppnådd ved bruk av et CGM-sett med 13 sporer. For hele oppsamlingstiden (15 t 6 min, \(t=0\) – begynnelsen av laseroppvarming), spiret 4 av 13 sporer, ved påfølgende tidspunkt \(t=2\) t, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' og \(11\) h \(30\)'. Selv om bare én av disse hendelsene er vist i figur 6, kan 4 spiringshendelser observeres i M6-filmen i tilleggsmaterialet. Interessant nok ser spiringen ut til å være tilfeldig: ikke alle sporer spirer og spirer ikke samtidig, til tross for de samme endringene i miljøforholdene.
en Time-lapse bestående av 8 OT-bilder (oljenedsenking, 60x, 1,25 NA objektiv) og (b) biomasseutvikling av G. stearothermophilus-aggregater. c (b) Tegnet på en semi-log skala for å fremheve lineariteten til veksthastigheten (stiplet linje).
På fig. 6b,c viser biomassen til cellepopulasjoner i synsfeltet som en funksjon av tid over hele datainnsamlingsperioden. Det raske forfallet av den tørre massen observert ved \(t=5\)h i fig. 6b, c, på grunn av utgangen av noen celler fra synsfeltet. Veksthastigheten for disse fire hendelsene er \(0,77\pm 0,1\) h-1. Denne verdien er høyere enn veksthastigheten knyttet til figur 3. 3 og 4, hvor cellene vokser normalt. Årsaken til den økte veksthastigheten til G. stearothermophilus fra sporer er uklar, men disse målingene fremhever interessen til LA-HTM og arbeider på enkeltcellenivå (eller på enkelt mCFU-nivå) for å lære mer om dynamikken i cellelivet .
For ytterligere å demonstrere allsidigheten til LA-HTM og dens ytelse ved høye temperaturer, undersøkte vi veksten av Sulfolobus shibatae, en hypertermofil acidofil arkea med en optimal veksttemperatur på 80°C51. Sammenlignet med G. stearothermophilus har disse archaea også en helt annen morfologi, som ligner 1 mikron kuler (kokker) i stedet for langstrakte staver (basiller).
Figur 7a består av sekvensielle optiske dybdebilder av S. shibatae mCFU oppnådd ved bruk av CGM (se M7 spillefilm i Supplementary Materials). Denne mCFUen vokser ved rundt 73°C, under den optimale temperaturen på 80°C, men innenfor temperaturområdet for aktiv vekst. Vi observerte flere fisjonshendelser som fikk mCFUer til å se ut som mikrodruer av archaea etter noen timer. Fra disse OT-bildene ble mCFU-biomasse målt over tid og presentert i figur 7b. Interessant nok viste S. shibatae mCFUer lineær vekst i stedet for den eksponentielle veksten sett med G. stearothermophilus mCFUer. Det har vært en langvarig diskusjon 52 om arten av celleveksthastigheter: mens noen studier rapporterer veksthastigheter for mikrober som er proporsjonale med deres størrelse (eksponentiell vekst), viser andre en konstant hastighet (lineær eller bilineær vekst). Som forklart av Tzur et al.53, krever det å skille mellom eksponentiell og (bi)lineær vekst en presisjon på <6 % i biomassemålinger, noe som er utenfor rekkevidde for de fleste QPM-teknikker, selv med interferometri. Som forklart av Tzur et al.53, krever det å skille mellom eksponentiell og (bi)lineær vekst en presisjon på <6 % i biomassemålinger, noe som er utenfor rekkevidde for de fleste QPM-teknikker, selv med interferometri. Цур и др.53, различение экспоненциального и (for) линейного роста требует точности <6% вос достижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Som forklart av Zur et al.53 krever det å skille mellom eksponentiell og (bi)lineær vekst <6 % nøyaktighet i biomassemålinger, noe som er uoppnåelig for de fleste QPM-metoder, selv ved bruk av interferometri.Som forklart av Zur et al. 53, å skille mellom eksponentiell og (bi)lineær vekst krever mindre enn 6 % nøyaktighet i biomassemålinger, noe som er uoppnåelig for de fleste QPM-metoder, selv når interferometri brukes. CGM oppnår denne nøyaktigheten med sub-pg nøyaktighet i biomassemålinger36,48.
en Time-lapse bestående av 6 OT-bilder (oljenedsenking, 60x, NA-mål 1.25) og (b) mikro-CFU-biomasseutvikling målt med CGM. Se film M7 for mer informasjon.
Den perfekt lineære veksten av S. shibatae var uventet og har ennå ikke blitt rapportert. Imidlertid forventes eksponentiell vekst, i det minste fordi det over tid må oppstå multiple delinger av 2, 4, 8, 16 … celler. Vi antok at lineær vekst kan skyldes cellehemming på grunn av tett cellepakking, akkurat som celleveksten bremses ned og til slutt når en sovende tilstand når celletettheten er for høy.
Vi avslutter med å diskutere følgende fem punkter av interesse etter tur: reduksjon i oppvarmingsvolum, reduksjon i termisk treghet, interesse for gullnanopartikler, interesse for kvantitativ fasemikroskopi og et mulig temperaturområde der LA-HTM kan brukes.
Sammenlignet med resistiv oppvarming, gir laseroppvarming brukt til HTM-utvikling flere fordeler, som vi illustrerer i denne studien. Spesielt i flytende medier i synsfeltet til mikroskopet holdes oppvarmingsvolumet innenfor noen få (10 μm) 3 volumer. På denne måten er bare de observerte mikrobene aktive, mens andre bakterier er i dvale og kan brukes til å studere prøven videre – det er ikke nødvendig å endre prøven hver gang en ny temperatur må kontrolleres. I tillegg tillater oppvarming i mikroskala direkte undersøkelse av et stort temperaturområde: Figur 4c ble hentet fra en 3-timers film (Movie M3), som vanligvis krever klargjøring og undersøkelse av flere prøver - en for hver av prøvene som studeres. y er temperaturen som representerer antall dager i eksperimentet. Å redusere det oppvarmede volumet holder også alle de omkringliggende optiske komponentene i mikroskopet, spesielt objektivlinsen, ved romtemperatur, som har vært et stort problem for samfunnet så langt. LA-HTM kan brukes med alle linser, inkludert oljenedsenkingslinser, og vil holde seg i romtemperatur selv med ekstreme temperaturer i synsfeltet. Hovedbegrensningen til laseroppvarmingsmetoden som vi rapporterer i denne studien er at celler som ikke fester seg eller flyter kan være langt fra synsfeltet og vanskelig å studere. En løsning kan være å bruke linser med lav forstørrelse for å oppnå en større temperaturøkning på over noen hundre mikron. Denne forsiktigheten er ledsaget av en reduksjon i romlig oppløsning, men hvis målet er å studere bevegelsen til mikroorganismer, er høy romlig oppløsning ikke nødvendig.
Tidsskalaen for oppvarming (og kjøling) av systemet \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) avhenger av størrelsen , i henhold til loven \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), hvor \ (L\ ) er den karakteristiske størrelsen på varmekilden (diameteren på laserstrålen i vår studie er \(L\ ca. 100\) μm), \(D\) er den termiske diffusiviteten til miljøet (gjennomsnittlig i vår kasse, glass og vann Diffusjonshastighet\(D\ ca. 2\ ganger {10}^{-7}\) m2/s Derfor, i denne studien, tidsresponser i størrelsesorden 50 ms, dvs. kvasi-øyeblikkelig). temperaturendringer, kan forventes. Denne øyeblikkelige etableringen av temperaturstigning forkorter ikke bare varigheten av eksperimentet, men tillater også nøyaktig timing \(t=0\) for enhver dynamisk studie av temperatureffekter.
Vår foreslåtte metode kan brukes på alle lysabsorberende underlag (for eksempel kommersielle prøver med ITO-belegg). Imidlertid er gullnanopartikler i stand til å gi høy absorpsjon i det infrarøde og lav absorpsjon i det synlige området, hvor sistnevnte egenskaper er av interesse for effektiv optisk observasjon i det synlige området, spesielt ved bruk av fluorescens. I tillegg er gull biokompatibelt, kjemisk inert, optisk tetthet kan justeres fra 530 nm til nær infrarød, og prøvepreparering er enkel og økonomisk29.
Transversal grating wavefront microscopy (CGM) tillater ikke bare temperaturkartlegging i mikroskala, men også biomasseovervåking, noe som gjør den spesielt nyttig (hvis ikke nødvendig) i kombinasjon med LA-HTM. I løpet av det siste tiåret har andre temperaturmikroskopiteknikker blitt utviklet, spesielt innen bioimaging, og de fleste av dem krever bruk av temperaturfølsomme fluorescerende prober54,55. Imidlertid har disse metodene blitt kritisert og noen rapporter har målt urealistiske temperaturendringer i celler, muligens på grunn av det faktum at fluorescens avhenger av mange andre faktorer enn temperatur. I tillegg er de fleste fluorescerende prober ustabile ved høye temperaturer. Derfor representerer QPM og spesielt CGM en ideell temperaturmikroskopiteknikk for å studere liv ved høye temperaturer ved hjelp av optisk mikroskopi.
Studier av S. shibatae, som lever optimalt ved 80°C, viser at LA-HTM kan brukes til å studere hypertermofiler, ikke bare enkle termofile. I prinsippet er det ingen grense for temperaturområdet som kan nås ved bruk av LA-HTM, og til og med temperaturer over 100°C kan nås ved atmosfærisk trykk uten koking, som demonstrert av vår gruppe på 38 innen hydrotermisk kjemi ved atmosfærisk trykk A. En laser brukes til å varme opp gullnanopartikler 40 på samme måte. Dermed har LA-HTM potensial til å bli brukt til å observere hypertermofiler uten sidestykke med standard optisk mikroskopi med høy oppløsning under standardforhold (dvs. under miljøstress).
Alle eksperimenter ble utført med et hjemmelaget mikroskop, inkludert Köhler-belysning (med LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), prøveholder med manuell xy-bevegelse, objektiver (Olympus, 60x, 0,7 NA, luft, LUCPlanFLN60X eller 60x, Oil NA, 1,25 NA , UPLFLN60XOI), CGM-kamera (QLSI kryssgitter, 39 µm pitch, 0,87 mm fra Andor Zyla-kamerasensor) for å gi intensitet og bølgefrontbilde, og sCMOS-kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bits modus, fra Hamamatsu) for å ta opp data vist i figur 5 (bakteriell svømming). Den dikroiske stråledeleren er en 749 nm BrightLine-kant (Semrock, FF749-SDi01). Filteret foran på kameraet er et 694 kortpassfilter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanium safir laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpet tsunami laser hulrom, Spectra-Physics i Fig. 2-5, videre erstattet av Millenia laser, Spectraphysics 10 W, pumpet Mira laser hulrom, Koherent, for Fig. 2 -5). 6 og 7) er satt til bølgelengden \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, som tilsvarer plasmonresonansspekteret til gullnanopartikler. Romlige lysmodulatorer (1920 × 1152 piksler) ble kjøpt fra Meadowlark Optics. Hologrammene ble beregnet ved å bruke Gerchberg-Saxton-algoritmen som beskrevet i lenken 39.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) er en optisk mikroskopiteknikk basert på å kombinere et todimensjonalt diffraksjonsgitter (også kjent som kryssgitter) i en avstand på én millimeter fra en konvensjonell kamerasensor. Det vanligste eksemplet på en CGM som vi har brukt i denne studien kalles et fire-bølgelengde transversal shift interferometer (QLSI), hvor kryssgitteret består av et intensitet/fase sjakkbrettmønster introdusert og patentert av Primot et al. i 200034. De vertikale og horisontale gitterlinjene skaper rutenettlignende skygger på sensoren, hvis forvrengning kan behandles numerisk i sanntid for å oppnå den optiske bølgefrontforvrengningen (eller tilsvarende faseprofil) til det innfallende lyset. Når det brukes på et mikroskop, kan et CGM-kamera vise den optiske baneforskjellen til et avbildet objekt, også kjent som optisk dybde (OT), med en følsomhet i størrelsesorden nanometer36. I enhver CGM-måling, for å eliminere eventuelle defekter i de optiske komponentene eller strålene, må et primært referanse-OT-bilde tas og trekkes fra eventuelle påfølgende bilder.
Temperaturmikroskopi ble utført ved bruk av et CGM-kamera som beskrevet i referansen. 32. Kort sagt, oppvarming av en væske endrer brytningsindeksen, og skaper en termisk linseeffekt som forvrenger den innfallende strålen. Denne bølgefrontforvrengningen måles av CGM og behandles ved hjelp av en dekonvolusjonsalgoritme for å oppnå en tredimensjonal temperaturfordeling i det flytende mediet. Hvis gullnanopartiklene er jevnt fordelt gjennom prøven, kan temperaturkartlegging gjøres i bakteriefrie områder for å produsere bedre bilder, noe vi noen ganger gjør. Referanse CGM-bildet ble tatt uten oppvarming (med laseren av) og deretter fanget på samme sted i bildet med laseren på.
Tørrmassemåling oppnås ved å bruke det samme CGM-kameraet som brukes til temperaturavbildning. CGM-referansebilder ble oppnådd ved å raskt flytte prøven i x og y under eksponering som et middel for å beregne gjennomsnittlig inhomogenitet i OT på grunn av tilstedeværelsen av bakterier. Fra OT-bilder av bakterier ble deres biomasse oppnådd ved å bruke et ensemble av bilder over områder valgt ved hjelp av Matlabs hjemmelagde segmenteringsalgoritme (se underavsnitt "Numerisk kode"), etter prosedyren beskrevet i ref. 48. Kort fortalt bruker vi relasjonen \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), hvor \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) er det optiske dybdebildet, \(m\) er tørrvekten og \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) er en konstant. Vi valgte \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, som er en typisk konstant for levende celler.
Et dekkglass 25 mm i diameter og 150 µm tykt belagt med gullnanopartikler ble plassert i et AttofluorTM-kammer (Thermofisher) med gullnanopartikler vendt opp. Geobacillus stearothermophilus ble fordyrket over natten i LB-medium (200 rpm, 60°C) før hver dag med eksperimenter. En dråpe på 5 µl av en suspensjon av G. stearothermophilus med en optisk tetthet (OD) på 0,3 til 0,5 ble plassert på et dekkglass med gullnanopartikler. Deretter ble et rundt dekkglass 18 mm i diameter med et hull på 5 mm i diameter i midten sluppet på dråpen, og 5 μl bakteriesuspensjon med samme optiske tetthet ble gjentatte ganger påført midten av hullet. Brønnene på dekkglass ble preparert i henhold til prosedyren beskrevet i ref. 45 (se tilleggsinformasjon for mer informasjon). Tilsett deretter 1 ml LB-medium til dekkglasset for å forhindre at væskelaget tørker ut. Det siste dekkglasset plasseres over det lukkede lokket på Attofluor™-kammeret for å forhindre fordampning av mediet under inkubering. Til spireforsøk brukte vi sporer, som etter konvensjonelle forsøk noen ganger dekket det øverste dekkglasset. En lignende metode ble brukt for å oppnå Sulfolobus shibatae. Tre dager (200 rpm, 75°C) med preliminær dyrking av Thiobacillus serrata ble utført i medium 182 (DSMZ).
Prøver av gullnanopartikler ble fremstilt ved hjelp av micellær blokk-kopolymerlitografi. Denne prosessen er beskrevet i detalj i kap. 60. Kort fortalt ble miceller som innkapslet gullioner syntetisert ved å blande kopolymeren med HAuCl4 i toluen. De rensede dekkglassene ble deretter nedsenket i løsningen og behandlet med UV-bestråling i nærvær av et reduksjonsmiddel for å oppnå gullfrø. Til slutt ble gullfrø dyrket ved å bringe et dekkglass i kontakt med en vandig løsning av KAuCl4 og etanolamin i 16 minutter, noe som resulterte i et kvasi-periodisk og veldig jevnt arrangement av ikke-sfæriske gullnanopartikler i det nære infrarøde området.
For å konvertere interferogrammene til OT-bilder brukte vi en hjemmelaget algoritme, som beskrevet i lenken. 33 og er tilgjengelig som en Matlab-pakke i følgende offentlige depot: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pakken kan beregne intensitets- og OT-bilder basert på registrerte interferogrammer (inkludert referansebilder) og kameraarray-avstander.
For å beregne fasemønsteret brukt på SLM for å oppnå en gitt temperaturprofil, brukte vi en tidligere utviklet hjemmelaget algoritme39,42 som er tilgjengelig i følgende offentlige depot: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Inngangen er ønsket temperaturfelt, som kan stilles inn digitalt eller via et monokromt bmp-bilde.
For å segmentere cellene og måle tørrvekten deres, brukte vi vår Matlab-algoritme publisert i følgende offentlige depot: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. På hvert bilde må brukeren klikke på bakterien eller mCFU av interesse, justere tryllestavens følsomhet og bekrefte valget.
For mer informasjon om studiedesign, se naturforskningsrapporten som er knyttet til denne artikkelen.
Data som støtter resultatene av denne studien er tilgjengelig fra de respektive forfatterne på rimelig forespørsel.
Kildekoden som brukes i denne studien er detaljert i metodedelen, og feilsøkingsversjoner kan lastes ned fra https://github.com/baffou/ i følgende depoter: SLM_temperatureShaping, CGMprocess og CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Innsikt i termofile og deres bredspektrede anvendelser. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Innsikt i termofile og deres bredspektrede anvendelser.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. og Sharma, AK Oversikt over termofile og deres brede anvendelse. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. og Sharma AK En dyp forståelse av termofile og et bredt spekter av bruksområder.3 Bioteknologi 6, 81 (2016).
Innleggstid: 26. september 2022